引言重组牛生长素 (rbST)，也称为生长激素，用于产奶母牛以提高牛奶产量。不同的法规对它的使用都有所规定，但由于缺少对其进行检测的有效方法 [1]，使得这些法规难以得到应用。这可能引发动物添加剂和食使用 LC-ESI-MS/MS 检测牛奶中的重组牛生长素应用品安全方面的争端。事实上，使用了这种激素的乳牛所产的奶中可能存在 rbST 残留。为了检测牛奶中的 rbST 残留，已确定选择对胰蛋白酶水解的 rbST N 末端肽链进行分析，尤其是针对内源性激素与重组激素所存在的差异。内源性牛生长激素的 N 末端氨基酸为丙氨酸，而在重组形式中则被蛋氨酸取代。本文阐述了使用 ESI(+)LC-MS/MS 检测 rbST 的方法。该方法成功应用于加有 rbST 标样的牛奶样品提取物。

实验部分蛋白质和肽类标准品rbST 蛋白质标准品和重组马生长素 reST(EquiGen-5) 分别来自 Harbor-UCLA Medicalcenter, National Hormone ａnd Pituitary Program(Torrance, CA, USA) 和 Bresagen Limited 公司(Thebarton, Australia)。以下序列的肽类标准品由 Millegen 公司 (Labege,France) 合成：MFPAMSLSGLFANAVLR (胰蛋白酶水解的 rbST N 末端肽链）、MFPAMPLSSLFANAVLR(胰蛋白酶水解的 reST N 末端肽链) 和 AFPAMSLSGLFANAVLR (胰蛋白酶水解的 bST N 末端肽链)。

仪器设备用于 N 末端肽链检测的仪器设备及设置如下表所示。

LC仪器 Agilent 1200色谱柱 Column Interchrom ModuloCart QSUptisphere 3HDO 150 mm × 2 mm流动相 A: 乙腈+0.1% 甲酸溶液B: 水+0.1% 甲酸溶液流速 0.3 mL/min进样量 20 µL梯度 时间（分钟） %A0 105 5510 6015 10017 1020 10MS仪器 Agilent 6410 LC/MS 三重串联四杆电离模式 ESI (+)毛细管电压 5000 V雾化器压力 55 psi气流 13 L/min气体温度 300 °C

选择性反应监测分析 (SRM) 方法参数为了获得较好的特异性，在 SRM 模式下进行检测。监测的 transition 如表 1 所示。

结果和讨论三重串联四杆 MS-MS 和电喷雾电离模式方法学的应用在本方法中，选用了正离子模式的电喷雾电离。事实上，这种表现为“软”电离技术的电离模式对于肽类检测为合适。rbST N 末端肽链的电离产生两种主要离子形式 (z=2 或 z=3)。这种基于三重串联四杆质谱的方法学应用具有很好的灵敏度和选择性，并且有可能对所监测信号实现定量分析。不同化合物的分离所开发的这种检测方法不仅用于 rbST 的胰蛋白酶水解 N 末端肽链的检测，还用于内源性脑垂体牛生长素 (bST) 和 reST 的胰蛋白酶水解 N 末端肽链的检测。reST 被用作内标，因为它的氨基酸序列与rbST 具有高度的相似性。三种化合物得到了色谱分离，并用表 1 的 transition进行分析。进样量为 0.2ng, bST、rbST 和 reST N 末端肽链所对应的色谱图如图1所示。

低，但仍然是有效的，能够清楚而明显地显示出来。本方法显然能够用于牛奶中 rbST 的准确鉴定。

结论牛奶中的 rbST 通过 ESI(+)LC-MS/MS 得到了检测。该方法显示了非常好的灵敏度、特异性和稳定性。按照 2002/657 号法令中的限度要求，使用该方法成功地对加有 50ng.mL-1 rbST 的牛奶样品进行了检测。

原创作者：上海斯迈欧分析仪器有限公司