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安捷伦液相色谱仪改进对生物样品中代谢物的分离

点击次数:73 发布时间:2023/4/24 20:28:17

引言:在药代动力学(DMPK)研究中,体外和体内实验的目的都是鉴定与药物相关的组分 [2,3]。当某些特殊代用配置亚 2 微米粒径色谱柱的液相色谱仪改进对生物样品中代谢物的分离应用谢物只用 LC-MS 鉴定还不够,需要更多结构信息时,用 LC 分离就成了关键步骤,要为核磁共振(NMR)分析等其它鉴定方法提供样品。代谢物要从各种复杂基质中分离,如血浆、尿液、粪便、肝脏和胆汁。在亚 2 微米小粒径柱提供的快速和高分离度的推动下,对常规 HPLC 方法重新评价,是否能作为一种缩短代谢物分离时间的方法[4, 5]。


 

实验高分离度快速液相色谱用一些实验来确定,在高分离度快速液相色谱(RRLC)系统上用 1.8 微米色谱柱是否改善了色谱分离。所用的 RRLC 系统见图 1。• 1200 系列 SL 型二元泵,配置微量真空脱气机• 1200 系列高性能自动进样器• 1200 系列柱温箱• 1200 系列高速可变波长检测器• 1100 系列分析馏分收集器色谱柱采用几种不同柱长和填料粒径的 ZORBAX SBC18。为了保持恒定的样品加载量和流速,内径固定在 4.6 mm。要获得合适体积的馏分,流速设置约为1 mL/分钟。所用色谱柱的详细情况如下:


 

• 4.6 x 250 mm, 5 µm, 部件号 880975-906• 快速分离 4.6 x 150 mm, 3.5 µm,部件号 863953-902• 快速分离高通量 4.6 x 150 mm, 1.8 µm,部件号829975-902• 快速分离高通量 4.6 x 100 mm, 1.8 µm,部件号828975-902相关的方法参数包括:流动相 A: 10 mM 醋酸铵,用醋酸调至 pH 5.0,流动相 B: 75:25 乙腈: 甲醇。可变波长检测器(VWD)检测波长 235 nm,峰宽设置 > 0.005 分钟,或 0.12-响应时间,配置标准流通池(部件号 G1314-60086)。


 

原方法(4.6 x 250 mm 柱)的梯度表如下:时间 %B0 2035 3550 5555 10055.1 到 60 20快速分离(RR)和快速分离高通量(RRHT)柱越短,时间将成比例地缩短。


 

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样品尿样的分析结果见图 2 和图 3。尿液样品的制备包括,取 10 倍量的尿液在室温下真空离心干燥浓缩,然后用起始流动相复溶。进样,样品再次离心,去除微粒。这种方法也可以用于血浆、肝脏匀浆和粪便匀浆。样品制备包括,用三倍体积的溶剂(1:3,样品:乙腈)旋涡混合分别提取三次,并离心。取出上清,混合,干燥。提取物用起始流动相复溶,离心,然后进样。在大多数情况下,胆汁可以不经过样品制备直接进样。10 20 30 40 50 minmAU010020010 20 30 40 50 minmAU010020010 20 30 minmAU010020010 20 30 minmAU010020010 20 minmAU0100200M5 M13 M15M5 M13 M15 M17M5M13 M15M17M5M13 M15M17RR SB-C18 4.6 × 150 mm, 3.5 µmSB-C18 4.6 × 250 mm, 5 µmRRHT SB-C18 4.6 × 150 mm, 1.8 µmRRHT SB-C18 4.6 × 100 mm, 1.8 µmୁۯ၎: A: 10 mM ٛ໗ᯕLjᆩٛ໗ۙ዁ pH 5.0 B: 75:25 (ᅚ᪜ǖोـ(༱܈ :ᇑዹׯ׊Բ૩Lj९ኟ࿔ୁ໏: 1.0 mL/min৊ᄣଉ: 100 µL (גሜLjᆩᇀଽݴ๭ण)࿒܈ :25 °Cॠ֪: UV 232 nmᄣ೗: ᆩଽݴ๭णഗݴ૗ටౖዐᄲ६ۨپڦႇ࿿M17图 2. SB-C18 柱的可缩放性提高了 DMPK 代谢物分离方法的通量尿样分析的结果见图 1 和图 3。鉴定出的感兴趣药物代谢物为色谱图中的 M5、M13、M15 和 M17。


 

结果与讨论在我们实验室里,因为待测样品的复杂性,用4.6 mm x 250 mm, 5 微米柱进行色谱分析的时间,可能在 60 分钟到 3 个小时。本研究的目标就是要用现有的方法,在保持分离度和测试量的同时,缩短分析时间。

每次进样加载物质的量部分地决定了所用的柱内径。通常,感兴趣的代谢物以每毫升纳克到微克水平存在于基质中,大量内源性物质占样品中的绝大部分。为了从内源性物质中获得大量的代谢产物,经常要使色谱柱超载。大量内源性物质加载到色谱柱上,导致超载,影响色谱分离的完整性。要减少内源性物质与感兴趣代谢物的共洗脱,必须采取少量多次进样。对这种长达 1 小时的分析,多次进样只分离非常少量的物质,显得相当浪费时间。虽然我们实验室不要求高通量,但提高通量还是很重要。这里显示的是用 Agilent 1200 系列高分离度快速液相色谱快速分离柱得到的结果。代谢研究中经常要用 14C 同位素标记化合物,将其作为一种有效方法,鉴定被内源性化合物背景掩盖下的药物相关物质。用亚 2 微米色谱柱进行的这类研究将在以后的论文中发表。这里分析的是次从人体实验得到的样品,药物没有标记 14C 同位素标记。为了分离制备,只监测和报告了 UV 响应。


 

在图 2 中,显示了对尿样分析的比较,样品中需要分离的代谢物水平非常低。原来在 ZORBAX SB-C184.6 mm x 250 mm, 5 µm 柱上建立的方法,分析时间为 60 分钟。本样品在用于比较的 4.6 mm x 100 mm,1.8 µm 柱和 4.6 mm x 150 mm, 1.8 µm 及 3.5 µm 柱上分离。梯度曲线按柱长比例更改。正如所期望的,随着粒径和柱长的减少,分离度和UV 响应都有了增加。对每根色谱柱每种代谢物 UV响应和峰宽的比较见表 1。每种代谢物的峰形都有明显改善,可以看到理论塔板数的增加。请注意,如果用更小的 2.1 µm 内径柱,柱效还有可能进一步改善。图 2 还显示了方法的耐用性和用 SB-C18 的可缩放性。不同的柱子配置,包括粒径和长度,对选择性的影响很小。从四种分离都具有相同的洗脱曲线就可以看出这一点。由于为了每次分析纯化出大量的代谢物,有意识地让色谱柱超载,所以感兴趣的峰有拖尾现象。


 

结论结果表明 RRHT 技术提高了实验室的效率。用 RRHT柱取代常规色谱柱,在不影响分离度的情况下,提高了通量。大的收获是用更小粒径(1.8 或 3.5 um)色谱柱,分离度的提高大。用 RRHT 柱取代了常规尺寸色谱柱后,峰高和峰宽都有了改善。另外,分析时间与柱长成比例地缩短。这些优点将带来实验室效率的提高。本方法在对复杂基质进行分析时(例如,尿和血浆)很容易在不同配置的 SB-C18 柱(包括不同的粒径)之间放大和缩小,大限度地简化了样品制备。

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原创作者:上海斯迈欧分析仪器有限公司

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