言单克隆抗体 （mAb） 型药物代表了发展迅速的类生物药物，对这类药物需要进行深入表征，以便获得临床试验和后续上市的批准。鉴于单克隆抗体具有分子量大及存在翻译后修饰（糖基化）的特征，精确质量数测定是单克隆抗体分析表征中具挑战性的步骤。这些特性也使得修饰位置的测定更加复杂。为了应对抗体质量数测定相关的挑战，人们使用了大量补充方法。可以用 PNGase F 处理抗体去除 N-糖链，后用 IdeS 等蛋白酶酶解获得抗体片段，也可还原单克隆抗体，以生成轻链和重链，随后进行质量数测定。这些技术可以各种组合加以应用。样品处理可能费时费力，而且重现性不佳。本应用简报展示了如何使用 Agilent AssayMAP Bravo 的自动化功能简化这些方法，减少引入人为误差的可能性，提高重现性，并实现更长的无人值守时间

我们使用两种明确表征的抗体，展示了安捷伦如何提供从原始样品到样品处理、数据采集和数据分析的完整质量数分析全面解决方案。采用结合生物素化 HER2 ECD（曲妥单抗）或生物素化蛋白质 L （NIST mAb） 的 AssayMAP 链霉亲和素 （SA-W） 小柱，通过 AssayMAP Bravo 对细胞培养上清液进行亲和纯化，得到特异性作用于 HER2 胞外区 （ECD） 的单克隆抗体赫赛汀（曲妥单抗）和 NIST 单克隆抗体标准物质 8671。蛋白质 L 是种抗体 κ 轻链的亲和试剂。之后，分别使亲和纯化后的赫赛汀和 NIST mAb 保留完整、用 PNGase F 去糖基化或用 IdeS 酶解处理，同时使用柱上反应应用将其固定在 AssayMAP 小柱上。将 PNGase F 和 IdeS 反应生成的可溶性产物（分别为糖链和 Fc/2 重链片段）收集在个孔板中。将半固定的完整 mAb、去糖基化 mAb 和 F（ab＇）2 片段从小柱中洗脱到含还原缓冲液的孔中，并将另半样品洗脱到非还原缓冲液中。所有这些步骤均在 AssayMAP Bravo 上自动进行。为了获得高质量数准确度的数据，这些步骤获得的蛋白质数据均使用 UHPLC 与 Q-TOF 质谱的联用系统进行分析。

实验部分材料重组人 HER2 胞外区 （ECD） 购自 ACRO Biosystems （Newark, DE）。EZ-Link Sulfo-NHS-LC 生物素试剂盒和 Pierce 生物素定量试剂盒购自赛默飞世尔科技公司 （Grand Island, NY）。快速 PNGase F 购自 New England Biolabs （Ipswich, MA）。IdeS 蛋白酶购自 Promega （Madison, WI）。赫赛汀（曲妥珠单抗）制剂由基因泰克 （South San Francisco, CA） 生产。单克隆抗体参比物质 8671 购自美家标准技术研究院 （NIST）。CHO 细胞培养上清液购自 Aldevron （Madison, WI）。采用安捷伦科技公司 （Santa Clara, CA） 的 AssayMAP 链霉亲和素小柱 （SAW）。其余全部化学品均购自 SigmaAldrich （St. Louis, MO）。

抗体亲和小柱的构建使用 EZ-Link Sulfo-NHS-LC 生物素试剂盒对人表皮生长因子受体 （HER2） ECD 和蛋白质 L 进行生物素化。将生物素与 HER2 ECD 的摩尔比确定为 9.5，生物素与蛋白质 L 的摩尔比确定为 5.3。按照 Pierce 生物素定量试剂盒的说明测定这些比值。

利用 AssayMAP Bravo 中的固定化应用程序（图 3），使用 AssayMAP Bravo 将 2 µg 生物素化的 HER2 ECD （表 1 中的色谱柱 1 和 2）以及 2 µg 生物素化蛋白质 L（表 1 中的色谱柱 3 和 4）固定在每根链霉亲和素 （SA-W） 小柱上。根据经验确定以缓慢流速有效结合目标分子所需的生物素化配体的小质量数，并将生物素化捕获配体与目标分子的摩尔比视为 5:1 左右。简而言之，用 1% 甲酸对 SA-W 小柱进行灌注和平衡（第 3 板位，图 3），然后采用内部小柱清洗 1 步骤，用 50 µL HEPES 缓冲液（10 mM HEPES，150 mM NaCl，pH 7.4，第 5 板位，清洗 1）清洗。使用 1% 甲酸进行灌注和平衡可排出小柱内夹带的空气，同时还能严格地清洗小柱，去除其中的链霉亲和素单体，避免它们在低 pH 条件下从固相载体上解离。用 HEPES 缓冲液重新平衡。这步骤使缓冲液流到小柱树脂床上，为小柱与 HEPES 缓冲液中的生物素化抗原结合做准备。接下来，用阻断剂上样步骤，在 100 µL HEPES 缓冲液（第 9 板位）中，以 5 µL/min 的流速在 SA-W 小柱中上样 2 µL 生物素化的 HER2 ECD 或蛋白质 L。构建亲和小柱的后步是采用内部小柱清洗 2，使用 50 µL HEPES 缓冲液清洗次。固定化应用中的其他步骤均选择关闭并自动跳过。图 3 显示了用于执行此运行过程的固定化应用程序设置屏幕截图。

抗体纯化将商购的赫赛汀（曲妥珠单抗）和 NIST mAb 在去离子水中复溶为 20 mg/mL，等分，并在 –80 °C 下储存。使用将赫赛汀和 NIST mAb 用水稀释至 1 µg/µL。然后将两种 mAb 加入 CHO 细胞上清液，至 2 µg/100 µL 的浓度。AssayMAP Bravo 中的亲和纯化应用程序可用于从细胞培养物上清液中纯化抗体（图 4）。将灌注和平衡步骤关闭，因为这些步骤都是在固定化操作期间完成的。然后，将 100 µL 加入赫赛汀 mAb 或 NIST mAb 的 CHO 细胞上清液分别以 3 µL/min 上样到每个 HER2 ECD 和蛋白质 L 亲和小柱上，之后用 150 µL HEPES 缓冲液以 10 µL/min 的流速清洗（内部小柱清洗 1）。表 1（步骤 1）显示了如何将小柱应用于不同的样品。A 到 F 的色谱柱 1 和 2（12 根小柱）上样生物素化 HER2 ECD。A 到 F 的色谱柱 3 和 4（12 根小柱）上样生物素化蛋白质 L。

原创作者：上海斯迈欧分析仪器有限公司