摘要 ：本应用简报展示将 Agilent InfinityLab 二维液相色谱解决方案与 Agilent 6495 三重 四杆液质联用系统结合使用，分析药代动力学研究中的药物及其代谢物。二维液 相色谱可避免出现共洗脱，因此能够减少信号抑制以及交叉干扰风险，这些问题可 能存在于复杂样品的维分析中。通过以更适合的洗脱方式将分析物引入质谱离子 源，2D-LC/MS/MS 分析方法的第二维可用于提高质谱检测的信号强度。

言 ：在过去十年间，LC/MS/MS 已成为了药 代动力学研究中用于分析药物及其代谢物 的项成熟技术。这项技术除高选择性、 高分析灵敏度以及在峰归属或分子量信息 等方面具有明显优势以外，也遇到了些 众所周知的困难，如难以对血浆或细胞培 养基等基质复杂的生物样品进行分析。另 外，还存在同质异位素共洗脱或代谢物源 内碎裂导致的交叉干扰，以及基质组分共 洗脱导致的信号抑制等挑战。信号抑制的 问题在低浓度分析物定量时尤为突出，可 能造成定量限不达标。 就如何将 Agilent InfinityLab 二维液相色 谱解决方案与 Agilent 6495 三重四杆液 质联用系统结合在生物分析研究环境中克 服上述难题，本应用简报详细列举了两个 示例，分别是： • 二维分离方案如何避免出现共洗脱， 以及如何在处理复杂分析物混合物时 降低交叉干扰风险或减少信号抑制 • 如何利用第二维通过改变洗脱条件提 高质谱检测的信号强度，从而以更适 合的洗脱液将分析物引入质谱离子 源，大幅提高定量限 

实验部分： 设备 Agilent 1290 Infinity II 二维液相色谱系统 包括以下模块： • 两台 Agilent 1290 Infinity II 高速泵 (G7120A) • Agilent 1290 Infinity II Multisampler (G7167B)，配备冷却装置（选件 #100） • Agilent 1290 Infinity II 高容量柱温箱 (G7116B) • Agilent 1290 Infinity 阀驱动 (G1170A)，配备 2 位/4 通双向阀 （二维液相色谱阀 1300 bar：部件号 5067-4244） • 两个 Agilent 1290 Infinity 阀驱动 (G1170A)，配备带 40 µL 定量环的多 中心切割阀 (G4242-64000) • 质谱 (MS) 检测采用配备安捷伦喷射 流电喷雾离子源 (G1958-65538) 的 Agilent 6495 三重四杆液质联用系 统进行

软件 • Agilent OpenLAB CDS ChemStation 版，版本 C.01.07 SR2 [263] 以及二 维液相色谱软件，版本 A.01.03 [025] • Agilent MassHunter 工作站 LC/MS 数据采集软件，版本 B.08.00，Build 8.0.8023.5 SP1 • Agilent MassHunter 工作站定量分析 软件，版本 B.07.01，Build 7.1.524.0 

化学品 LC/MS 乙腈和甲醇购自 TH Geyer (Renningen, Germany)。LC/MS 分析所 使用的甲酸和乙酸铵购自 Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany)。 新制超纯水产自配置 0.2 µm 膜式终端 过滤器的 ELGA Pureflex 2 水纯化系统 (Veolia Water Technologies Deutschland GmbH, Celle, Germany)。 样品和方法 利用二维液相色谱避免信号抑制和交叉 干扰 进行体外细胞悬液测定，鉴定负责候选药 物代谢的关键酶。在细胞悬液中对候选药 物（小分子）和多种酶特异性探针底物及 相应酶抑制剂进行温育。经过段时间 后，收集样品并分析代谢物的形成。为避 免信号抑制或交叉干扰，采用色谱法对高 丰度底物和抑制剂进行了分离。进样溶液 中含有细胞上清液与稳定同位素标记内标 溶液的混合物。方法参数如表 1 所示。 二维液相色谱通过溶剂切换提高质谱检 测灵敏度 通过体外细胞培养测定评估母体化合物 （候选药物）及其三种主要代谢物在培养 基和细胞中的浓度。在预设温育时间结束 后采集样品，加入非稳定同位素标记的内 标，然后进样。方法参数如表 2 所示。

 结果与讨论 利用二维液相色谱避免信号抑制和交叉 干扰 在酶底物和抑制剂存在的条件下，体外细 胞悬液测定得到的细胞培养上清液中含有 各种代谢物，因此属于复杂混合物。图 1 所示为细胞培养上清液的 LC/MS/MS 分 析结果。突出显示的代谢物 M1 与浓度更 高的底物和抑制剂发生了共洗脱。在此次 LC/MS/MS 分析中，代谢物 M1 发生信号 抑制，原因是该代谢物与丰度更高的底物 和抑制剂发生了共洗脱。对于结构相关化 合物，还可能有交叉干扰的问题。 要避免信号抑制和交叉干扰，分析细胞上 清液时需要采用种能够将代谢物与底物 和抑制剂分离开来的色谱方法。

原创作者：上海斯迈欧分析仪器有限公司