摘要 ：Agilent Captiva 增强型脂质去除产品 EMR-Lipid (Captiva EMR—Lipid) 是款在 SPE 小柱或 96 孔板中使用的直通式净化产品。本研究展示了采用 Captiva EMR—Lipid 96 孔板对人血清中九种代表性药物化合物进行 LC/MS/MS 定量测定。样品的处理方法为：采用原位蛋白质沉淀 (PPT) 去除蛋白质，然后采用 Captiva EMR—Lipid 净化去除油脂。整项研究是在 96 孔板上进行批处理。使用同位素或内标类似物对血清中所有九种药物化合物在 0.5–200 ng/mL 校准动态范围建立了定量分析方法。采用为期三天的准确度和精度运行来验证方法。结果显示此方法具有出色的校准曲线线性 R2 > 0.99，QC 的所有五个水平都具有优异的准确性（定量下限 (LLOQ) < 20%，其他水平的 < 15%）以及精度 (RSD < 15%)。本文也对方法的选择性和交叉污染进行了评估。结果表明，采用原位 PPT 和 Captiva EMR—Lipid 净化包确立的方案显著改善了生物基质中药物化合物定量分析结果的可靠性。

言定量测定生物基质中目标药物和代谢化合物的生物分析方法通常采用基于 96 孔板的高通量样品处理方法。将样品直接等量加入 96 孔板，分析物萃取和基质净化的所有的样品处理操作都在 96 孔板中进行。该流程具有较高的效率和生产力，广泛用于生物分析行业。生物定量分析的方法验证通常涉及严格、全面的要求，包括重复曲线的校准曲线线性、校准标样准确度、动态范围内强化质量控制 (QC) 样品的准确度和精度、方法的选择性、交叉污染和样品处理中分析物稳定性试验。严格的可接受标准为定量下限 (LLOQ) 为 100%±20% 准确度、其他水平为 100%±15% 准确度，LLOQ 为 ≤ 20% RSD，其他水平为 ≤ 15% RSD1 。基于 96 孔板的样品处理技术通常包括固相萃取 (SPE)、液液萃取 (LLE)、固相支持液相萃取 (SLE) 以及蛋白质沉淀 (PPT)2 。SPE 应用广泛，可用于生物体液中小分子的 LC/MS/MS 定量分析，能够高效完成基质净化。但是， SPE 需要进行更多的方法开发研究，还需要采用多个步骤来进行捕集，然后再洗脱目标分析物3 。相比 SPE，LLE 或 SLE 有时能够更高效地去除磷脂，但强性分析物的回收率通常又是大难题4 。PPT 是生物体液样品处理方法中简单、经济的种，因此被广泛采用。有机溶剂如乙腈或甲醇用于解离生物体液样品，去除蛋白质。该方法并不会去除磷脂，因此会为定量分析方法和仪器维护带来很多问题5 。

Agilent Captiva 增强型脂质去除 EMRLipid (Captiva EMR—Lipid) 产品系列是种新型吸附材料，能够选择性去除样品基质中的主要脂类且不会造成分析物意外损失。脂质去除作用机制是利用体积排阻以及脂类的长脂肪链与 EMR—Lipid 吸附剂之间的疏水作用。选择性相互作用机制可以在 PPT 后有效地从生物体液中去除磷脂和其他种类的脂质。Captiva EMR—Lipid SPE 小柱/多孔板可以在直通净化后进行原位 PPT。其他应用简报对生物体液中磷脂去除效率进行了全面评估和对比6 ，证实了在 PPT 处理后， Captiva EMR—Lipid 具有出色的磷脂去除效率。在本项研究中，采用 Captiva EMR—Lipid 96 孔板方案对生物体液中的代表性小分子药物化合物进行了定量分析，并且获得了出色结果。所选的药物化合物在性（亲水性和疏水性）和官能性（酸性、中性和碱性）方面差别很大。图 1 列出了目标分析物的化学性质和结构。根据标准生物分析方法验证指南对方法进行了验证。此外，研究三个样品批次的磷脂去除和分析物回收率，对 Captiva EMR—Lipid 吸附剂批次间重现性进行了评估。


实验试剂与化学品所有试剂和溶剂均为 HPLC 或分析纯。乙腈 (ACN) 购自 Honeywell (Muskegon, MI, USA)。试剂甲酸 (FA) 购自安捷伦公司（部件号 G2453-85060）。化学标准品和其他化学品以纯粉末或标准储备液购自 Sigma (St. Louis, MO, USAI)。人血清购自 Biological Specialty Corporation (Colmar, PA, USA)。标样和溶液标样和内标 (IS) 储备液用甲醇或 DMSO 配制，浓度为 2.0 mg/mL。混合标样加标溶液分别采用 1:1 乙腈/水配制，浓度为 25 µg/mL。添加至等量样品的内标工作溶液采用 2:8 ACN/水配制，浓度为 2 µg/mL。向 20 mL 乙腈中加入 200 µL FA，制成 1% FA 的乙腈溶液。该溶液用于蛋白质沉淀。将 385.3 mg 醋酸铵溶解到 1 L Milli-Q 水中，然后加入 1 mL FA，从而制得 0.1% FA 的 5 mM 醋酸铵缓冲液（作为流动相 A）。向 1 L 乙腈中加入 1 mL FA，制成 0.1% FA 的乙腈溶液（作为流动相 B）。将 77.06 mg 醋酸铵溶于 200 mL Milli-Q 水中，制得 5 mM 醋酸铵溶液。以 9:1 的比例混合缓冲液和乙腈，制成复溶溶液。混合 80 mL 乙腈和 20 mL 水，制成 80:20 乙腈/水溶液。

仪器与材料用于样品处理的仪器 • Centra CL3R 离心机 (Thermo IEC, MA, USA) • Eppendorf 移液器和连续分液器 • ViaFlo 96 液体处理器 (Integra, Hudson, NH, USA) • Captiva 真空夹（部件号 A796） • 真空泵 (Gast, Benton Harbor, MI, USA) • CentriVap 浓缩仪，冷阱和真空计 (Labconco, Kansas City, MO, USA) • Agilent Captiva EMR—Lipid 96 孔板（部件号 5190–1001） • Agilent Captiva 96 孔板 1 mL 收集盘（部件号 A696001000） • Agilent Captiva 96 孔板盖，10/包（部件号 A8961007）

仪器条件采用 Agilent 1290 Infinity UHPLC 系统进行分析，该系统包括： • Agilent 1290 Infinity 二元泵 (G4220A) • Agilent 1290 Infinity 高性能自动进样器 (G4226A) • Agilent 1290 Infinity 柱温箱 (G1316C)
……
结论本文验证了用于定量测定人血清中九种代表性药物化合物的样品处理方法，该方法先后采用 PPT 和 Agilent Captiva 增强型脂质去除净化。用时三日的准确度和精度运行结果验证了该方法具有较宽的动态范围，重复的校准曲线具有可重现的线性，并且具有出色的日内和日间准确度和精度。标样柱后注射研究表明，与仅 PPT 和先后采用 PPT 和其他脂质去除净化相比，本方法显著减少了基质离子抑制效应。从出色的定量结果可以看出，干净的基质使得建立的方法更为可靠。干净的基质允许使用 IS 类似物甚至是结构不相干的 IS，而不必采用昂贵、稳定的同位素标记 IS，使得方法验证更轻松，样品分析更为经济。

原创作者：上海斯迈欧分析仪器有限公司