摘要：普遍认为低分子量 (LMW) 或高分子量 (HMW) 物质等产品相关杂质是治疗性单克隆抗体 (mAb) 产品的关键质量属性 (CQAs)，需要在整个药物生产过程中进行监测。本应用简报基于 Agilent 1290 Infinity II 生物液相色谱系统结合带 PEEK 内衬的 AgilentPLRP-S 色谱柱的性能，开发了一种 RPLC 方法。通过分析 NISTmAb 的还原重链和轻链，即使梯度斜率非常平缓的情况下，也可观察到相对保留时间和面积偏差。方法开发后，两条重链 (H2) 或两条重链一条轻链 (H2L) 等所有相关 LMW片段均可得到分离与检测。得益于与 UV 和 MS 检测器的依次联用，该方法可用于生物药物生产链的多个域。该方法也可作为 SDS-PAGE/CE-SDS 的替代方法，在一次运行中分析两种 CQAs ― LMW 物质以及翻译后修饰 (PTMs)。

言 ：mAbs 是生物药物中一类主要的产品，已成功用于各类疾病的治疗[1]。这些生物分子具有保守的异四聚体结构，由两条重链和两条轻链通过二硫键连接组成。在生产过程中或储存不当时，可能会形成某些产品相关杂质，如 LMW 物质（见图 1）或HMW 物质（如抗体二聚体）。即使经过大量纯化步骤，这些杂质也可能也仍会存在，因此有必要将它们作为药品的 CQA进行监测。抗体二聚体、三聚体或多聚体等 HMW 物质可通过体积排阻色谱 (SEC)和 UV 检测进行常规分析和分离[2]。SEC与 MS 检测联用，可用于进一步表征杂质的相关分子量和 PTMs[3]。重链 (H)、轻链 (L) 或 H2L 片段等 LMW 物质可通过毛细管电泳-十二烷基硫酸钠 (CE-SDS) 进行分析[4]。遗憾的是，由于 SDS 引起的高离子抑制，CE-SDS 无法与 MS 检测联用，因此 LMW 物质的推测鉴定通常根据经验知识进行。本应用简报基于 1290 InfinityII 生物液相色谱系统和带 PEEK 内衬的 PLRP-S 色谱柱的性能，展示了mAbs 的 LMW 物质的另一种分析方法。由于采用了反相液相色谱 (RPLC) 模式，NISTmAb 的所有相关还原诱导 LMW 片段均可通过 UV 和 MS 进行检测，以根据需要用于常规或深入分析。

实验部分设备与 Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF联用的 Agilent 1290 Infinity II 生物液相色谱系统包括以下模块：– Agilent 1290 Infinity II 生物高速泵(G7132A)– Agilent 1290 Infinity II 生物 Multisampler(G7137A)，配备样品恒温箱（选件#101）– Agilent 1290 Infinity II 高容量柱温箱(G7116B)，配备一个标准流速 QuickConnect 快速连接生物热交换器(G7116-60071) 和两个安捷伦热平衡装置 (G7116-60013)– Agilent 1290 Infinity II 可变波长检测器(VWD) (G7114B)，配备生物微量流通池（用于 VWD，3 mm，2 µL，RFID）– Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF(G6545XT)

软件– Agilent MassHunter 工作站数据采集软件（B.09.00 或更高版本）– Agilent MassHunter 定性分析软件（10.0 或更高版本）– Agilent MassHunter BioConfirm（10.0 或更高版本）色谱柱Agilent PLRP-S 5 µm 1000 Å,2.1 × 100 mm，带 PEEK 内衬（部件号 PL1912-2502PK）化学品使用 Agilent InfinityLab 超纯 LC/MS 乙腈（部件号 5191-4496）和 AgilentNISTmAb（部件号5191-5744）。新制超纯水来自配置 0.22 µm 膜式终端过滤器(Millipak) 的 Milli-Q Integral 水纯化系统(Millipak, Merck-Millipore, Billerica, MA,USA)。DL-二硫苏糖醇 (DTT) 购自 Merck(Darmstadt, Germany)。

样品处理将 40 µg NISTmAb 与 1 mmol/L DTT 在棕色玻璃样品瓶中孵育，4 °C 下直接置于 1290 Infinity II 生物 Multisampler 中，可实现 NISTmAb 的部分还原。将 40 µgNISTmAb 与 10 mmol/L DTT 在 60 °C 下孵育 30 分钟，可实现重链 (H) 和轻链(L) 的还原。进样浓度为 1 mg/mLNISTmAb 或还原 NISTmAb。‘

结果与讨论：从制造到质量控制的整个生产过程中，对生物药物的分析都需要液相色谱系统尽可能提供性能。为评估 1290 Infinity II生物液相色谱系统在 mAb 片段分析方面的性能，利用 DTT 将 NISTmAb 还原成 H 和 L 片段。图 2 展示了七次连续进样获得的相对保留时间和峰面积标准偏差 (RSD)。结果表明，1290 Infinity II 生物液相色谱系统与 6545XT AdvanceBioLC/Q-TOF 联用的保留时间和峰面积，非常适合以平缓梯度分析 mAb抗体片段。尽管液相色谱方法由两个线性梯度步骤组成（斜率分别为 0.32% 和0.55% B/min），但保留时间和峰面积精度的 RSD 值仍较低，者为 0.190% (L)和 0.056% (H)，后者为 0.530% (L) 和0.744% (H)。采用 RPLC 分析 LMW 物质时的一大挑战是由于它们的疏水性与实际 mAb 相似，因此对 H2 或 H2L 等抗体片段的分离能力有所欠缺。这些片段可以在发酵过程中产生，也可以由终产品发生部分还原得到。而这些片段也可通过少量 DTT 或降温的方式经过一定时间的部分还原而人工生成。利用这项技术，开发了一种基于带PEEK 内衬的 PLRP-S 色谱柱和 1290 InfinityII 生物液相色谱系统的 RPLC 方法。

图 3 的色谱图显示了 NISTmAb 在 1290Infinity II 生物 Multisampler 中的动态还原情况。由于添加了 DTT，图 1 所示的所有相关 mAb 片段均实现很好的分离和随时间的变化。尤其是 H2、H2L 片段和 NISTmAb 在 RPLC 中实现了非常分离，因此带 PEEK 内衬的 PLRP-S 色谱柱和 1290 Infinity II 生物液相色谱系统的结合是分析 LMW 的方法。得益于 RPLC 模式，1290 Infinity II 生物液相色谱系统可轻松与 6545XT AdvanceBioLC/Q-TOF 联用，MS 数据可在 AgilentMassHunter BioConfirm 软件中进行分析。解卷积后，各片段的主要糖型如

图 3 所示。NISTmAb 的特征性糖基化表明，该方法可轻松分析不同片段的PTMs。此外，图 4B 所示为 mAb 峰周围聚集片段的代表性离子的提取离子色谱图(EIC)。得益于带 PEEK 内衬的 PLRP-S 色谱柱分离能力，这些 EICs 也具有良好的峰形。由于仪器设置依次包括 1290 Infinity II可变波长检测器和 6545XT AdvanceBioLC/Q-TOF，因此可在一次运行中同时进行 UV 和 MS 检测，几乎无谱带展宽，并可轻松完成过程开发到质量控制的方法转移（图 4A）。

结论传统 SDS-PAGE 和现代等效的 CE-SDS 均广泛应用于 LMW 和 HMW 物质等产品相关杂质的分析。然而，利用这些方法鉴定 LMW 物质结构一直面临着挑战，且主要基于经验知识。本应用简报介绍了一种RPLC 方法，该方法能够分离 NISTmAb所有相关还原诱导 LMW 物质。基于重链和轻链片段分析结果，1290 Infinity II生物液相色谱系统展现出保留时间和峰面积精度值。在 1290 Infinity  II生物 Multisampler 中对 NISTmAb 进行动态还原，随后用 6545XT AdvanceBio010203040506070809010016 19 22 25放大的 EIC 响应 (%)保留时间 (min)HLHNISTmAbH2LH2B00.51.01.52.000.050.100.150.200.250.3015 19 23 27保留时间 (min)A × 108 TIC 响应 (–) 响应 (mAU)图 4. 一次运行中获得的 NISTmAb 周围聚集片段的 MS 和 UV 谱图 (A)。NISTmAb 片段的提取离子色谱图，展现出峰形 (B)LC/Q-TOF 进行检测，这一系列操作展现了该方法分析翻译后修饰的潜力。与片段分析相结合时，这种能力可加速生物药物的发展。这就是在生产工艺到终质量控制的生物药物分析过程中，带 PEEK 内衬的 PLRP-S 色谱柱和 1290 Infinity II 生物液相色谱系统能够适应未来需求的原因

原创作者：上海斯迈欧分析仪器有限公司