摘要：电荷异构体分析是一项对所用液相色谱系统有较高要求的应用，因为它需要使用腐 蚀性的高浓度盐缓冲液和非常平缓的梯度来实现佳分离。使用 Agilent 1290 Infinity II 生物液相色谱系统对不同的盐梯度进行评估，并分析分离度和重现性。 1290 Infinity II 生物液相色谱系统包括高速泵及其完全不含铁的流路，非常适合用于 生物色谱条件，可避免对系统造成潜在的腐蚀性损坏。即使对于挑战性的平缓 梯度也表现出出色的重现性，证实了 1290 Infinity II 生物液相色谱仪作为新一代安捷伦液相色谱系统，生成的数据具有高可信度。

言：1290 Infinity II 生物液相色谱系统配备高 性能高速泵。与低压混合泵（如四元泵） 相比，二元泵的主要优势在于，它能够更 准确、更精密地混合小比例溶剂组分。这 种精确混合能力可以在溶剂梯度开始和 结束时提供高精度的溶剂组成[4]。这是生 成可重现且准确的平缓梯度（每个通道 低于 1%/min）的基础。 1290 Infinity II 生物液相色谱是新一代安 捷伦液相色谱系统，为生物色谱条 件（如 2 mol/L NaCl、高达 8 mol/L 尿素 的高盐浓度，以及如 0.5 mol/L NaOH 或 0.5 mol/L HCl 的高/低 pH 溶剂）而设计。 整个流路完全不含不锈钢 (SST) 或铁；贯 穿 Multisampler、高容量柱温箱和检测器 的所有毛细管和接头均由 MP35N（一种镍 钴合金）制成。这种材料可以减少高浓度 盐缓冲液的潜在腐蚀，避免因铁离子存在 引起的蛋白质修饰（如氧化、蛋白质复合 物形成）。 本应用简报介绍了对曲妥珠单抗和 NISTmAb 参比标样的电荷异构体的分 析。研究中测试了不同的盐梯度斜率，以 便达到佳分离。然后评估了佳梯度斜 率的重现性。单克隆抗体 (mAbs) 是一种高度异质性大 分子，大小约为 150 kDa，通常通过重 组法生产。它们的生产要经历复杂的生 物合成过程，这一过程中可发生大量修 饰，从而产生数百种不同的异构体。脱 酰胺化、氧化、二硫键、N-糖基化、N-末 端和 C-末端加工是常见的翻译后修饰 (PTMs)。所有这些修饰均可在合成过程 中发生，但生产和储存过程也会增加这些 大分子的复杂性。PTMs 会形成复杂的异 构体分布，需要进行全面的分析和监测， 因为终药品中的修饰可能与生物活性丧 失、半衰期改变或免疫原性增加相关[1]。 某些 PTMs 会导致分子形成电荷异构 体，通常使用离子交换色谱 (IEX) 对这些 异构体进行分析[2]。电荷异构体是重要 的关键质量属性 (CQAs) ，因此需要 严格的验收标准和质量控制。确认产品正 确生产并鉴别和定量任何杂质至关重要。 平缓梯度洗脱在蛋白质的 IEX 中非常常 见。用于洗脱蛋白质的离子强度模式中的 典型盐梯度约为 1–3 mmol/min，pH 值 的允许误差为 ±0.02 个 pH 单位[3]。

实验部分 设备 Agilent 1290 Infinity II 生物液相色谱系统，包括以下模块： • Agilent 1290 Infinity II 生物高速泵 (G7132A) • Agilent 1290 Infinity II 生物 Multisampler (G7137A)，配备样品恒 温箱（选件 #101） • Agilent 1290 Infinity II 高容量柱温箱 (G7116B)，配备标准流速生物兼容 性热交换器 • Agilent 1290 Infinity II 可变波长检测 器 (G7114B)，配备生物兼容性微量 流通池，3 mm，2 µL 软件 Agilent OpenLab CDS 2.5 版 色谱柱 Bio MAb, NP5, 2.1 × 250 mm, PEEK（部 件号 5190-2411） 化学品 所有试剂纯度均为液相色谱。新制超 纯水来自配置 0.22 µm 膜式终端过滤器 (Millipak) 的 Milli-Q Integral 水纯化系统 (Millipak, Merck-Millipore, Billerica, MA, USA)。磷酸二氢钠一水合物、磷酸氢二 钠七水合物、氯化钠、盐酸、氢氧化钠、 三羟甲基甲胺、咪唑购自 Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany)。

样品 • Agilent-NISTmAb（部件号 5191-5744） • 人源化单克隆抗体曲妥珠单抗（商 品名为赫赛汀）购自 Roche (Basel, Switzerland) • 曲妥珠单抗溶于 30 mmol/L 磷酸盐 缓冲液中，pH 6.8 缓冲液配制 配制 2 L 30 mmol/L 磷酸盐缓冲液 (pH 6.8)：称取 4.45 g 磷酸二氢钠一水合 物和 7.44 g 磷酸氢二钠七水合物加入 2 L 棕色瓶中，用超纯水定容至 2 L（& 缓 冲液  A）。将 29.22 g 氯化钠（总浓度 500 mmol/L）加入 1 L 棕色空瓶中，用配 制好的磷酸盐缓冲液 A 定容至 1 L（& 缓 冲液 B）。测量两种配制缓冲液的 pH 值，如有需要，将 pH 值调至 6.8（加入 大量盐会改变 pH 值）。配制的缓冲液均 使用 0.2 µm 滤膜过滤。

方法 见表 1。 注：使用高浓度盐溶液作为洗脱液时，需 要考虑在泵方法中设置相应溶剂类型。 例如，对于含 500 mmol/L 氯化钠的溶 剂 B，在泵方法的溶剂选择字段使用“氯 化钠 0.5 mol/L”而非一般水相或水。高浓 度盐可改变溶剂的压缩系数，因此使用预 先配置的溶剂表可以使泵达到佳性能。

结果与讨论 方法开发 为获得所需分离度并实现佳分离，电荷 异构体分析需要进行全面的方法开发。有 两个参数是成功的关键：佳 pH 值和 佳梯度斜率。这两个因素都会对分离产 生重大影响。先，建议进行 pH 筛选， 以找到用于实现分离的佳 pH。在之 的实验中，使用 pH 6.4–7.4 的缓冲液进 行分析，发现两种样品（曲妥珠单抗和 NISTmAb 参比标样）在 pH 6.8 时均获得 佳结果（数据未展示）。下一步是确定 理想的梯度斜率，以实现有效的分离。

原创作者：上海斯迈欧分析仪器有限公司