言：紫外-可见分光光度计测量为样品的质量控制检查提供了一种快速方法。它们 还可用于计算比活性或估算纯化后的产率，并鉴定含有蛋白质和氨基酸的组分。 含有芳香侧链氨基酸的蛋白质，在接近 280 nm 处产生吸收。因此可以使用紫外-可 见分光光度计进行定量分析。当吸收系数已知时，可根据比尔-朗伯定律 (1) 确定含 有这些氨基酸的蛋白质的浓度。通常蛋白质的样品量有限，以少体积进行测量对 于样品的保存至关重要。通过波长扫描可提供潜在污染物的信息。 Cary 3500 多池紫外-可见分光光度计具有光学准直的集成式多池支架，与超微 量比色皿（图 1）配合使用，非常适用于可重现的定性及定量测量。

本研究展示了Cary 3500 多池紫外-可见分光光度计在小体 积蛋白质样品定性和定量分析方面的优势。牛血清白蛋白 (Bovine serum albumin, BSA) 是常用的蛋白质标准品，其吸收 系数已知，我们将其用于本分析中。

实验部分 样品 配制 pH 7.0 的 0.01 mol/L 磷酸盐缓冲液 (PBS)。配制 10 mg/mL BSA 储备液，并稀释至 0.75、1.50、2.25、3.00 和 3.75 mg/mL。 使用六个孔径为 2 × 2.5 mm，容积 70 µL，光程 10 mm 的超 微量比色皿进行测量（图 1）。其中，一个作为参比，五个作 为样品。使用 3.5 mL、10 mm 光程的标准石英比色皿进行重 现性测量。采用 PBS 缓冲液作为参比溶液。 仪器和方法 所有测量均使用 Cary 3500 多池紫外-可见分光光度计。在 250–350 nm 范围内进行波长扫描，信号采集平均时间为 1 ， 数据间隔为 1 nm。无需预先校准系统。为证明重现性，用超微量比色皿 (70 µL) 重复测量 3.0 mg/mL BSA 溶液 20 次，其中参比位置为装有 PBS 缓冲液的相同超微 量比色皿。此外，使用 3.5 mL、10 mm 光程的标准石英比色 皿对同样的溶液进行另外 20 次重复测量，以装有 PBS 缓冲液 的相同比色皿作为参比。这些测量均在 278 nm 处进行，信号 采集平均时间为 1 ，光谱带宽为 2 nm。

结果 同步测量 空白样品和五种浓度 BSA 样品在 Cary 3500 多池紫外-可见 分光光度计中使用超微量比色皿（2 × 2.5 mm 孔，10 mm 光 程）进行同步测量。在 250–350 nm 范围内进行波长扫描以 定性分析样品（图 2）。然后将这些数据用于评估仪器的线性 （参见下文微量池部分中的线性）。

蛋白质纯度 350 nm 处的吸收强度可用于定量和校正存在于蛋白质样品中 的任何污染物。从图 2 可以看出，该测量样品在 350 nm 处的 吸光度为 0 Abs。因此，这些样品中 BSA 的浓度与光谱图的峰 大值成正比，根据这一关系可准确测定 BSA 的浓度。无需 杂质校正。 微量池线性 很明显，每个 BSA 波长扫描的峰大值均出现在 278 nm 处 （图 2）。使用 Cary 紫外工作站软件提取每个样品在 278 nm 处峰的吸收强度，并将其对每种所测样品中的蛋白质浓度作图 （图 3）。这些数据清晰地展示了 Cary 3500 系统的线性 （图 3）。结果表明，线性范围扩展至接近 2.5 Abs，即使使用 小孔超微量比色皿也是如此。

重现性 为证明重现性，在 70 µL、2 × 2.5 mm 孔径的超微量比色皿或 3.5 mL 标准比色皿中重复测量 3.0 mg/mL BSA 样品 20 次。 两种比色皿的光程均为 10 mm。超微量比色皿较小的窗口孔 径尺寸对测量的重现性（标准偏差）无影响，如图 4 所示。 70 µL 超微量比色皿的测量标准偏差为 0.00042，3.5 mL 标准 比色皿为 0.00029。使用超微量比色皿测得的吸光度平均值为1.863 Abs。使用 3.5 mL 标准比色皿测得的吸光度平均值为 1.858 Abs。两种比色皿所得结果的差异在仪器的测量不确定 度范围内。

使用小体积比色皿的风险在于较小的比色皿窗口（通常为比色 皿设计的一部分）孔径导致光通量减小。光通量减少会使线性 吸光度范围和测量重现性降低。Cary 3500 具有高度聚焦的光 束，可确保以大光通量通过样品，且重现性与 3.5 mL 标准 比色皿相同（图 4）。

讨论 如果已知吸收系数，可通过紫外-可见光谱图上的大吸收强 度进行定量测量。如此处测量的 BSA 样品，其吸收系数已 知。如果吸收系数未知，则必须通过测量多个标准品建立校准 曲线，并根据校准曲线的斜率计算吸收系数。这是一个耗时的 过程，并可能引起在实验结束都无法确定的测量误差。 分析人员可以选择在分析序列中加入已知浓度的样品来提高数 据的ke靠性。这些加入的样品充当内部对照。这种测量方法的 问题在于不能同时测量样品和标准品，因而在样品和标准品测 量之间各种变量可能发生改变。如本文所述（图 2），同步进 行样品和标样测试可大大减小其他环境变量或可能影响样品 处理的偏差。在测量可能不稳定的样品时，一次测量一个样品的方法可能会 导致结果错误。将样品置于实验台等待测量的过程中，它们的 吸光度可能会发生改变。引起这一改变的原因可能为温度变 化、照射到溶液的光线的影响或溶液中的化学变化。这可能导 致定量测量时出现系统误差。通过同步测量所有比色皿位置， Cary 3500 多池紫外-可见分光光度计可消除这些不利变量，并 提高所生成结果的ke靠性。同时，还可显著节省测量时间。

结论 Cary 3500 多池紫外-可见分光光度计为蛋白质的定性和定量分 析带来了新的可能。该系统采用独特的非移动式整体多池支 架，为提高分析效率和重现性而设计。通过同步测量八个比 色皿位置，可有效减少任何可能在后续测量过程中出现的不利 变量。这些特点共同造就了一个强大的分析型紫外-可见分光 光度计系统。

参考文献 1. Practical Handbook of Biochemistry ａnd Molecular Biology, Fasman, D.G., Ed. (1992). CRC Press, Boston

原创作者：上海斯迈欧分析仪器有限公司