摘要：分析与活性药物成分 (API) 有关的低浓度杂质对原料药的质量控制来说至关 重要。当杂质与 API 的化学结构相似且浓度差异较大时，色谱分离与检测将 变得困难。 Agilent 1290 Infinity II 二维液相色谱解决方案可实现全二维液相色谱 (LC × LC)、多中心切割二维液相色谱 (MHC) 以及高分辨率采样二维液相色 谱 (HiRes 2D-LC) 之间的轻松切换。在本应用简报中，使用高分辨率采样二 维液相色谱实现两种紧邻洗脱的化合物的分离，其中一种化合物浓度低且 隐藏在其他高浓度化合物峰下。以氯二氟苯甲酸和脱酰胺胰岛素分别作为标 准物质和实际样品进行分析。

言：原料药的纯度分析对于药物质量和患 者安全来说都非常重要1 。根据 ICH 指 南 Q3A(R2)，应对新原料药中含量大 于 0.05%2 阈值（相对于 API）的杂质 进行报告。对这些浓度下的杂质进行 分离和检测具有大的挑战性，尤其 当杂质结构与活性药物成分 (API) 具 有相似性时。 本应用简报以相对浓度为 100% 及 0.05% 的氯二氟苯甲酸的不同异构体 为例，展示了高分辨率 (HiRes) 采样 二维液相色谱在杂质分离与检测中的 应用。使用 Agilent 1290 Infinity II 高 动态范围二管阵列检测器 (HDRDAD) 杂质分析仪解决方案作为二维 检测器可以进一步提高本应用的精度 和准确度。以脱酰胺胰岛素作为实 际样品分析，以展示高分辨率采样 2D-LC/MS 对具有相似结构的杂质的 检测。此处，二维液相色谱还具备其 他优势，即第二维分离可作为脱盐步 骤，避免维缓冲液中的高盐含量 进入 MS 离子源造成离子抑制3 。使用 Agilent MassHunter 的第二维色谱图 生成器查看并分析 MassHunter 中的 2D-LC/MS 数据。 在高分辨率采样二维液相色谱中，在 选定时间范围内收集几个涵盖维 色谱图中整个峰面积范围的小体积馏 分，以此测定目标化合物，如图 1 所 示。每次切割都驻留在采样环中，并 在第二维中对所有切割进行连续分 析。这一模式可确保所有选定化合物 均转移至第二维，并在其中得到分 析。这样，选定的共洗脱化合物都经 过高分辨率采样处理，以在第二维中 进行分析。如技术概述4 所示，这一 操作可实现可靠的定量分析。

实验部分： 设备 Agilent 1290 Infinity II 二维液相色谱 解决方案包括以下模块： • 两台 Agilent 1290 Infinity II 高速 泵 (G7120A) • Agilent 1290 Infinity II Multisampler (G7167B)，配备 Infinity II 样品冷却装置（选件 #100） • 两台 Agilent 1290 Infinity II 高容 量柱温箱 (G7116B) • 三台 Agilent 1290 Infinity II 二 管阵列检测器 (G7117B)，配备 3.7 mm、10 mm、60 mm 大光 强卡套式流通池 (G4212-60008) • Agilent 1290 Infinity 阀驱动 (G1170A) 和 2 位/4 通双向阀 （二维液相色谱阀头，G4236A） • 两个 Agilent 1290 Infinity 阀驱动 (G1170A)，配备带 40 µL 定量环 的多中心切割阀 (G4242-64000)为分析脱酰胺胰岛素，将 Agilent 1290 Infinity II 二维液相色谱解决方案与配备 安捷伦双喷射流 ESI 离子源的 Agilent 6545 Q-TOF 联用。为避免维缓 冲液中的高含量盐进入离子源，按之 应用简报5 中的建议，使用时间表 进行 MS 分流阀切换，在每次第二维 分析的分钟将液流引入废液。

软件 • 带安捷伦二维液相色谱软件（产 品版本 A.01.03 [025]）和 Agilent HDR-DAD ChemStation 插件（产 品版本 A.01.01 [015]）的 Agilent OpenLAB CDS ChemStation 修订 版 C.01.07 SR2 [255] • Agilent MassHunter 工作站 LC/MS 数据采集软件，版本 B.08.00， Build 8.00.8026.0 • Agilent MassHunter 工作站定性 分析软件，版本 B.07.00，Build 7.0.7024.0 • 用于 MassHunter 的安捷伦第二维 色谱图生成器，修订版 1.0.15

化学品 所有试剂纯度均为液相色谱。乙 腈和硫酸钠购自 Merck (Darmstadt, Germany)。甲酸、磷酸、磷酸氢二钠 以及磷酸二氢铵购自 Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany)。新制超纯 水来自配置 0.22 µm 膜式终端过滤 器 (Millipak) 的 Milli-Q Integral 水 纯化系统 (Millipak, EMD Millipore, Billerica, MA, USA)。5-氯-2,4-二 氟苯甲酸、3-氯-2,4-二氟苯甲酸、 2-氯-4,5-二氟苯甲酸以及牛胰腺胰 岛素标准品均购自 Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany)。 样品 用 50/50 的水/乙腈配制浓度为 1 mg/mL 的氯二氟苯甲酸储备液。用 这些储备液配制不同浓度比的三种化 合物的混合物。 pH 为 2.55 时，将浓度为 1 mg/mL 的胰岛素溶于 25 mmol/L 的磷酸钠缓 冲液中。为使胰岛素脱酰胺基化，将 胰岛素溶液的 pH 值调为 9，并在室 温下放置 12 个小时。

……

结论 本应用简报展示了使用高分辨率采 样二维液相色谱对样品中与主要化 合物具有相似结构的低浓度杂质的 检测。根据 ICH 指南对新原料药中 杂质的相关规定，使用氯二氟苯甲 酸的混合物进行测试，结果显示相 对浓度为 0.05%、0.10%、0.15% 和 100% 且在维分析中无法单 独检测到的化合物，可通过高分辨 率采样二维液相色谱转移至第二 维色谱柱并进行分离。检测到的化 合物 5-氯-2,4 二氟苯甲酸的准确度 值为 71.6–108.5%。峰面积精度为 2.71–7.95%。以 Agilent 1290 Infinity II HDR-DAD 杂质分析仪解决方案作为 第二维检测器可以增加进样量，同时 可以改善准确度 (96.4–108.5%) 和峰面 积精度 (1.44–1.58%)。以脱酰胺胰岛 素作为实际样品，使用高分辨率采样 2D-LC/MS 进行分析。使用 Agilent MassHunter 的第二维色谱图生成器 评估数据。在两次切割中通过对应的 同位素模式检测并鉴定了胰岛素的单 一脱酰胺产物，两次切割均在维 胰岛素主峰拖尾处进行采集。

原创作者：上海斯迈欧分析仪器有限公司