摘要：由亚磷酰胺化学法合成的寡核苷酸通常使用离子对反相液相色谱 (IP-RPLC) 和阴离 子交换色谱进行分析和纯化。在 IP-RPLC 分析中，阴离子交换纯化馏分的高含盐量 会削弱寡核苷酸参与离子配对的能力。这就需要在 IP-RPLC 分析之对样品进行脱 盐，这一步骤通常使用离心过滤器手动完成。 本应用简报展示了高盐浓度溶液中寡核苷酸的直接二维液相色谱分析：在第yi维 ( 1 D) 中进行在线脱盐，随后在第二维 (2 D) 中进行 IP-RPLC 分析。在该设置中，二维 液相色谱的使用提高了工作流程速度，同时避免了手动的样品处理过程。

言：在分子生物学和分子诊断中，聚合酶链式 反应 (PCR)、基因沉默以及相关技术1 都 需要标准的和经修饰的合成寡核苷酸。此 外，合成寡核苷酸在作为治疗剂治疗各种 疾病（例如癌症和病毒性疾病）方面的重 要性日益突显2 。寡核苷酸类药物包括反 义寡核苷酸、小干扰 RNA (siRNA) 和适 配体。反义寡核苷酸和 siRNA 均通过阻 止 mRNA 翻译从而阻止蛋白质合成。适 配体通过形成适配体-蛋白质复合物，从 而抑制蛋白质的生物学功能3 。 寡核苷酸通常通过亚磷酰胺化学法合成2,4。 可获得的纯度通常大于 70%，合成后存 在的常见杂质包括缺失或增加序列的寡核 苷酸连同未去保护的产物、缺失嘌呤 碱基的寡核苷酸以及其他降解产物2 。通 常使用离子对反相液相色谱 (IP-RPLC) 和 阴离子交换色谱对合成的去保护寡核苷酸 进行分析分离与纯化2,4。阴离子交换纯化馏分通常含有高浓度的 盐，如氯化钠 (NaCl) 或溴化钠 (NaBr)。 当使用 IP-RPLC 对这些馏分进行分析时， 高浓度的盐会削弱寡核苷酸参与离子配对 的能力，从而导致保留时间变化、峰分裂 以及峰流穿5 。为了对阴离子交换纯化馏 分进行成功的 IP-RPLC 分析，需要在分 析对样品进行脱盐5 ，而这一过程通常 手动完成。 本应用简报展示了高盐浓度溶液中寡核苷 酸的直接二维液相色谱分析，这一盐浓度 与寡核苷酸合成后阴离子交换纯化馏分中 的盐浓度相当。二维液相色谱分析的第yi维用于在线脱盐，随后在第二维中进行 IP-RPLC 分析。在该设置中，二维液相色 谱的使用可以节省时间并避免手动的样品 处理步骤。省去手动样品处理步骤可 以提高重现性，且可以避免样品处理过 程中的样品损失。

实验部分 设备 Agilent 1290 Infinity II 二维液相色谱系统 包括以下模块： • 两台 Agilent 1290 Infinity II 高速泵 (G7120A) • Agilent 1290 Infinity II Multisampler (G7167B)，配备冷却装置（选件 #100） • 两台 Agilent 1290 Infinity II 高容量柱 温箱 (G7116B) • 两台 Agilent 1290 Infinity II 二管阵 列检测器 (G7117B)，配备 10 mm 大光强卡套式流通池 (G4212-60008) • Agilent 1290 Infinity 阀驱动 (G1170A)，带二维液相色谱阀、 主动溶剂调制 (G4243A) • 两个 Agilent 1290 Infinity 阀驱动 (G1170A)，配备带 40 µL 定量环的 多中心切割阀 (G4242-64000) 软件 Agilent OpenLab CDS ChemStation 版， 版本 C.01.08 [210] 以及二维液相色谱软 件，版本 A.01.04 SR1。 色谱柱 • Agilent PLRP-S 100 Å, 2.1 × 50 mm, 3 µm（部件号 PL1912-1300） • Agilent AdvanceBio 寡核苷酸色谱 柱，2.1 × 50 mm, 2.7 µm（部件号 659750-702）

化学品 所有试剂纯度均为液相色谱。甲醇购 自 Merck (Darmstadt, Germany)。新制超 纯水来自配置 0.22 µm 膜式终端过滤器 (Millipak) 的 Milli-Q 超纯实验室水纯化系统 (Millipore, Merck (Darmstadt, Germany))。 乙酸铵和六氟异丙醇 (HFIP) 购自 Merck (Darmstadt, Germany)。三乙胺 (TEA) 和 氨水分别购自 Fluka (Steinheim, Germany) 和 VWR (Darmstadt, Germany)。 样品与样品处理 将寡核苷酸分离度标准品、RNA 和 DNA 样品溶于水。得到的储备液用水或 2 mol/L NaCl 溶液按 1:1 进一步稀释，使水或 1 mol/L NaCl 溶液中具有相同浓度的寡核 苷酸。1 mol/L NaCl 的寡核苷酸溶液用 于模拟具有高盐浓度的阴离子交换纯化 馏分。 使用 Microcon YM-3 离心过滤器以及 3 kDa NMWCO (Millipore, Merck (Darmstadt, Germany)）按以下步骤对 1 mol/L NaCl 的寡核苷酸溶液进行手动 脱盐： • 将 1 mol/L NaCl 的寡核苷酸溶液 (200 µL) 转移到样品储液槽，14000 g 离心 30 分钟，以浓缩寡核苷酸并洗 脱盐分 • 将 200 µL 水转移到样品储液槽， 14000 g 离心 30 分钟以进行清洗• 将样品储液槽颠倒放入一个干净的样 品瓶，1000 g 离心 3 分钟，以使浓 缩物转移到样品瓶中 • 用水将浓缩物复溶，终体积约为 200 µL

寡核苷酸分离度标准品（部件号 5190-9028）： 14 mer：rCrArCrUrGrArArUrArCrCrArArU 17 mer：rUrCrArCrArCrUrGrArArUrArCrCrArArU 20 mer：rUrCrArUrCrArCrArCrUrGrArArUrArCrCrArArU 21 mer：rGrUrCrArUrCrArCrArCrUrGrArArUrArCrCrArArU RNA 样品（RNA/2’-OMethyl 混合；安捷伦 NSAD 合成）： 5’-GuGcCaAcCuGaUgCaGcU-3’，大写字母：RNA，小写字母：OMethyl DNA 样品（硫醇化；安捷伦 NSAD 合成）： 5’-ugcaCCCTGGATACCauuu-3’，大写字母：DNA，小写字母：OMethyl

结果与讨论 图 1 展示了水（图 1A）和 1 mol/L NaCl 溶液（图 1B）中寡核苷酸分离度标准品 的一维 IP-RPLC 分析。图 1B 清楚地显示 注入的寡核苷酸溶液中的高浓度盐会削弱 其参与离子配对的能力，从而导致峰分裂 以及峰流穿（可看见较大的进样峰）。 从图 2 经脱盐的寡核苷酸溶液的 IP-RPLC 分析可以看出，用离心过滤器对 1 mol/L NaCl 的寡核苷酸分离度标准品溶液进行 手动脱盐后可避免峰分裂以及峰流穿。然 而，使用离心过滤器进行手动脱盐是一个 费时费力的过程，通常耗费约 75 分钟。 此外，手动脱盐后单个寡核苷酸的强度比 发生了变化，这很可能是由较小的寡核苷 酸部分损失所致。 使用配备主动溶剂调制的 1290 Infinity II 二维液相色谱系统的中心切割二维液相色 谱可实现高盐浓度溶液中寡核苷酸的直接 分析。二维液相色谱分析的第yi维用于 在线脱盐，随后在第二维中进行 IP-RPLC 分析。

原创作者：上海斯迈欧分析仪器有限公司