摘要本应用简报介绍了一种快速测定食品中 β-胡萝卜素的在线固相萃取-液相色谱分析方法。该方法以 C8 色谱柱作为分析柱，样品经皂化后直接进样，系统自动完成目标化合物的富集、净化和分离等过程。通过实验优化了影响色谱分析的关键参数，并对方法学性能进行了系统考察。结果表明，该方法满足测定要求及现行标准方法要求，并且具有简便、快速、环境友好等优点，尤其适用于样品检测需求较高的实验室中。

前言β-胡萝卜素是类胡萝卜素，是维生素 A 的前体。它大量存在于植物中，是自然界中普遍存在且稳定的天然色素。与其他类胡萝卜素一样，β-胡萝卜素是一种抗氧化物，具有清除自由基的能力；作为维生素 A 的前体，β-胡萝卜素可以转化成维生素 A，是安全补充维生素 A 的产品，有助于维持眼睛和皮肤的健康、改善夜盲症、皮肤粗糙状况等，有很高的药理学及营养学价值。其广泛应用于医药、保健品、食品添加剂及化妆品等行业，并且作为食品添加剂、营养强化剂和医药制剂使用。GB5009.83-2016规定的食品中 β-胡萝卜素的测定方法通常包括皂化、石油醚的液-液萃取、旋蒸、氮吹和定容等样品前处理过程，仪器方法分析时间近 40 min[1]。整个分析过程繁琐、耗时，且 β-胡萝卜素易被氧化，方法回收率和重现性难以保证。本文采用在线固相萃取-液相色谱法，将样品皂化后直接上机分析，能够快速测定其中的 β-胡萝卜素含量。

实验部分试剂和样品抗坏血酸 (VC, C6H6O6)、氢氧化钾 (KOH)、2,6-二叔丁基-4-甲ji苯酚 (BHT) 和乙醇均为 HPLC 级，购自上海安谱实验室技术公司；甲醇和乙腈均为 HPLC 级，购自 Merck；甲基叔丁基醚 (MTBE)为 HPLC 级，购自 Tedia；β-胡萝卜素（纯度 99.9%）购自 LGC公司；奶粉、液态奶购自超市。仪器和设备采用安捷伦在线固相萃取-液相色谱系统，配备如下安捷伦模块：Agilent1260InfinityII四元泵（部件号G7111B×2）、Agilent1260InfinityII自动进样器（部件号G7129A）、Agilent 1260InfinityII柱温箱（部件号G7116A，内置2位6通阀）和 Agilent1260InfinityIIDAD（部件号G7117C，配备60mm超高灵敏度流通池）。软件采用AgilentOpenLabCDS2.6。

标准品储备溶液制备取 β-胡萝卜素标准品适量，置于100mL棕色容量瓶中；向其中加入0.1gBHT，用二氯甲烷溶解并定容至刻度，制得 β-胡萝卜素浓度为0.1049mg/mL的储备溶液。将其避光储存于–20°C下，有效期为1个月，临用前使溶液回温至20°C。标准品溶液制备取标准品储备溶液适量，加乙醇（含0.5gVC/L）稀释25倍，制得浓度为4.196?g/mL的标准品中间液；然后取该中间液适量，用 70% 乙醇（含0.5gVC/L）稀释得到浓度为0.2098?g/mL的标准品工作溶液。样品前处理取奶粉1.0g、液态奶 5 g，参照GB5009.83-2016的样品前处理方法，将奶粉先用10mL温水混匀，然后向其中分别加入1g抗坏血酸、45 mL 乙醇（含0.1gBHT）和15mL氢氧化钾溶液(1g/mL)；摇匀后置于53±2°C的水浴锅中；皂化 30 min 后取出，迅速冷却到室温；再加入 70% 乙醇（含0.4g/LVC），定容至100mL；然后在常温下离心，取上清液进样分析。

结果与讨论标准品和典型样品分离结果按照上述方法得到的色谱图如图2所示。样品中目标峰的分离不受基质成分干扰，便于对 β-胡萝卜素的总量进行测定。实验发现，在样品溶液制备过程中，目标化合物容易氧化，因此在皂化过程中加入 BHT，并用含有 VC 的 70% 乙醇溶液进行定容，以尽可能减少全反式 β-胡萝卜素的转化。

线性关系和定量限取标准品工作溶液，分别进样 0.5、2、5、10、20、50 和100?L，以标准品的进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，考察方法线性。结果如图 3 显示，β-胡萝卜素的线性方程为y=46.788x+1.9593，相关系数 (R2) > 0.9999，表明 β-胡萝卜素在0.1049–20.98ng范围内，获得了良好的线性关系；按照S/N=10计算，仪器的定量限(LOQ) 为 0.07 ng，当称样量为1g时，进样体积为100?L时，方法的定量限为0.07?g/g，优于现行国标方法[1]。

方法精度取浓度为0.2098?g/mL标准品溶液，连续进样 5 次，进样体积为100?L，计算目标峰的峰面积和保留时间的RSD。计算得出，β-胡萝卜素的保留时间RSD为0.02%，峰面积RSD为0.69%，表明该方法具有良好的精密度。

方法准确度分别取空白溶剂（70% 乙醇）、奶粉和液态奶样品，按照高、中、低三个水平加入标准品溶液，并按照样品溶液制备方法，制得待测溶液并上机分析；然后确定目标物的总量，并计算加标回收率。结果见表2。从表中可以看出，β-胡萝卜素的高、中、低三水平加标的平均回收率为101.98%，表明该方法整体测定结果的准确度良好。

结论本应用基于在线固相萃取技术初步建立了一种快速分析食品中 β-胡萝卜素含量的方法。其中样品经皂化后可直接上机分析，系统将自动完成目标物的净化、富集和分析全过程。该方法大幅简化了样品前处理过程，并提高了样品分析效率。初步方法学评估结果表明，该方法的线性、灵敏度、精密度和准确度均能满足目标化合物的定量要求，适用于测定实际样品中 β-胡萝卜素的含量。

原创作者：上海斯迈欧分析仪器有限公司