摘要：本文使用 Agilent Bond Elut PBA 固相萃取净化并结合安捷伦液质联用仪HPLC-MS/MS，建立了一种测定不同动物源食品（猪肉、猪肝、猪肾、羊肉、牛奶、鸡蛋）中潮霉素 B 的检测方法。在 10–500 ng/L 的浓度范围内，使用同位素内标校正所得到的线性相关系数高于 0.99；各种动物源食品中潮霉素 B 的方法检测限为 10 μg/kg，定量限为 20 μg/kg；在加标浓度为 20–250 ng/g 时，不同目标物的平均加标回收率和相对标准偏差分别在94.2%–110.8% 和 5.8%–10.2% 的范围内。该方法适用于多种动物源食品中潮霉素 B 残留的测定。

前言：潮霉素 B 是由吸水链霉菌产生的一种氨基糖苷类抗生素。其能够抑制蛋白质合成，从而杀死细菌、真菌和高等真核细胞，可有效控制猪蛔虫、食道口线虫和毛首线虫感染（例如，在妊娠母猪全价饲料中添加潮霉素 B，能够保护仔猪在哺乳期间不受蛔虫感染），同时对鸡蛔虫、鸡异刺续虫和禽封闭毛细线虫均有良好的控制效应[1]。GB 31650-2019[2] 中规定潮霉素 B 可用作治疗，但不得在动物性食品（可食组织、鸡蛋）中检出。因此，非常有必要建立动物源食品中潮霉素 B 的检测方法。GB/T 21323-2007[3] 介绍了一种检测动物组织中氨基糖苷类药物残留量的测定方法。该方法使用磷酸-三氯yi酸缓冲液进行提取，并使用离子对试剂七氟丁酸降低氨基糖苷极性，然后通过 C18 固相萃取柱进行净化。但该方法中的七氟丁酸使用量大，成本较高，且向流动相含有 20% 100 mmol/L 七氟丁酸会对质谱系统造成污染。本文在该标准的基础上，对样品前处理过程进行了改进。采用yi酸铵-三氯yi酸缓冲溶液进行提取，并通过具有机理的 Bond Elut PBA 进行固相萃取净化，其硅胶基体上键合的苯硼酸官能团对潮霉素 B 结构中的顺式-二醇官能团具有较强的选择性，在碱性条件下通过可逆共价键被保留，然后在酸性条件下洗脱，从而实现高选择性保留和净化效果。另外，该方法使用内标法进行定量，仅在上机前定容溶液中加入七氟丁酸，可避免污染系统。由此建立了一种适用于快速、简便地检测多种动物源基质中潮霉素 B 的方法。

实验部分试剂和样品实验用乙腈、甲酸、七氟丁酸均为色谱纯，购于北京迪马科技有限公司；实验用水为娃哈哈纯净水。潮霉素 B 和 d4-潮霉素 B 标准品：100 μg/mL（BePure，购于曼哈格公司，以水为溶剂）。基质样品为市售产品。仪器和设备采用 Agilent 1290 Infinity 液相色谱/6470 三重四极杆液质联用(LC/MS/MS) 系统；Agilent Vac Elut 20 位固相萃取装置。所用其他主要设备包括 3K-15 离心机（德国 Sigma 公司）和涡旋混匀器（德国 IKA 公司）。色谱柱采用 Agilent Poroshell 120 EC-C8, 3.0 × 100 mm, 2.7 μm（部件号 695975-306）。样品前处理采用 Agilent Bond Elut PBA（100 mg，3 mL，部件号 12102127）、Agilent ValueLab PES 微孔滤膜（0.2 μm，13 mm，部件号 5190-5273）、安捷伦陶瓷均质子（用于 50 mL离心管，部件号 5982-9313）。溶剂和标样配制分别取适量的标准品用乙腈:水 (50:50, V/V) 配制浓度为 10 mg/L的潮霉素 B 和 d4-潮霉素 B 内标标准工作液，逐级稀释备用。校准标样的配制：分别准确移取上述适量标准工作液，用 0.5%甲酸水（含 1% 七氟丁酸）稀释成浓度分别为 10、20、50、100、200、500 和 1000 μg/L 的标准溶液，其中内标浓度为50 μg/L，现配现用。 然后向其中加入 50 g 三氯yi酸，溶解并混匀后，加水定容至 1000 mL，摇匀后备用（在 4 °C下可保存 1 个月）。

样品前处理称取样品 5 g (±0.05 g) 于 50 mL 离心管中，添加一定量的内标；加入陶瓷均质子，向其中准确加入 5 mL 铵-三氯yi酸缓冲溶液，涡旋振荡 5 min；以 8000 r/min 离心 5 min，将上清液全部转移至15 mL 离心管中；将剩余残渣用 5 复提取一次，以 8000 r/min 离心 5 min 后合并上清液； pH = 8.5 (±0.2)，定容至 12 mL（将牛奶定容至 15 mL）；然后以 8000 r/min 离心 5 min，所得上清液用作备用液。将 Bond Elut PBA 固相萃取柱依次用 2 mL 乙腈、3 mL 0.5% 甲酸水、5 mL 0.2 mol/L  (pH = 8.5) 活化；取一半体积的备用液 (6 mL) 过柱（对于牛奶，则取 7.5 mL）；待样品液全部流出之后，依次用 3 mL 0.2 mol/L  (pH = 8.5) 和 3 mL 水淋洗，并抽干 2 min；加 2 mL 0.5% 甲酸水分两次洗脱；向洗脱液中加入 20 μL 七氟丁酸，涡旋混匀后，过 0.2 μm PES 滤膜，待液相色谱-串联质谱仪测定，前处理流程图见图 1。

液相色谱条件仪器 Agilent 1290 Infinity II 高速泵（部件号 G7120A）Agilent 1290 Infinity II 进样器（部件号 G7167B）Agilent 1290 Infinity II 高容量柱温箱（部件号G7116B）色谱柱 Poroshell 120 EC-C8, 3.0 × 100 mm, 2.7 μm流动相 A：0.5 mmol/L 乙酸铵，0.1% 甲酸水溶液B：乙腈流速 0.3 mL/min梯度 时间 (min) B (%)0 22.0 22.1 85.1 407.0 908.0 90后运行时间 3 min柱温 40 °C进样体积 10 μL

检测限和定量限通过空白基质中的加标回收试验来确定方法的检测限和定量限。当加标浓度为 10 ?g/kg 时仍可定性检出，目标物色谱峰的信噪比(S/N) 大于 3，由此确定该方法的检测限为 10 ?g/kg；当加标浓度为 20 ?g/kg 时，信噪比 (S/N) 大于 10，且回收率和重现性均能满足相关国家标准要求，由此确定该方法的定量限为 20 μg/kg。回收率和精密度本应用选择几种代表性的动物源食品，即猪肉、猪肝、猪肾、羊肉、牛奶和鸡蛋，分别添加 20、50、250 μg/kg 三个浓度样品，且每个加标水平设六个平行样，以此验证方法的准确度和精密度，结果见表 2。潮霉素 B 在不同动物源食品中的平均回收率和相对标准偏差分别在 94.2%–110.8% 和 5.8%–10.2% 的范围内，表明该方法具有良好的准确度和精密度。不同动物源食品中基质空白和潮霉素加标回收色谱图见图 3。

结论本文采用 HPLC-MS/MS 结合 Poroshell 120 EC-C8 色谱柱建立了一种检测动物源食品中潮霉素 B 的方法。该方法与 GB/T 21323-2007 相比，在上机前溶液中加入七氟丁酸，可大幅减少七氟丁酸的使用量并避免了离子对试剂对仪器的污染。同时，采用共价机理的 Agilent Bond Elut PBA 固相萃取柱对潮霉素 B 具有高选择性，可实现净化效果。该方法简便、高效，在 10–500 ng/mL 的浓度范围内具有良好的线性（线性相关系数 R2 高于 0.99）；且灵敏度（检测限为 10 μg/kg，定量限为 20 μg/kg）；不同动物源样品基质中潮霉素 B 的平均加标回收率和相对标准偏差分别在 94.2%–110.8% 和 5.8%–10.2% 的范围内，表明其具有良好的准确度和精密度。该方法适用于测定多种动物源食品中的潮霉素 B 残留。

原创作者：上海斯迈欧分析仪器有限公司