摘要：清洁验证 (CV) 是药品生产质量管理规范 (GMP) 对原料药和药品生产的要求。大多数药物的清洁验证研究通常选用配备紫外检测器的液相色谱仪，其灵敏度水平约为 20-50 ng/mL。对于高效药物，应用配备扩展光程流通池的紫外检测或质谱检测可实现灵敏度水平低至 ng/mL 的清洁验证方法。在 Agilent 6150 系列单四杆液质联用系统上使用安捷伦喷射流离子源的UHPLC/MS 方法具有更高的灵敏度，其显示出更低（约 0.5 ng/mL）的定量限 (LOQ)。此外，采用更高的进样量可进一步降低 LOQ。本研究介绍了对浓度范围为 0.5 ng/mL 至 1000 ng/mL 的五种模型药物的 2 分钟通用清洁验证方法。该通用清洁验证检测方法通常可适用于许多不同的药物，只需少的方法开发、认证和转换工作。本应用简报还介绍了采用用户补充的 NIST 质谱库搜索程序鉴定未知化合物。

言必须进行清洁验证 (CV) 以证明生产链（容器和加工设备）的清洁度，确认活性药物成分 (API) 已被充分去除，达到预先确定的可接受限值。开发针对高效药物（SafeBridge 类别 3B 或 41）或具有弱发色团的药物的高灵敏度CV 方法挑战性。对于高效药物而言，可接受标准通常要求检测限低至 ng/mL 。利用长光程 UV 流通池或质谱检测器能够提高传统 LC-UV 方法的灵敏度2。此外，偶尔观察到未知化合物，应当在 CV 研究中进行鉴定。本研究的目的是展示一种快速、灵敏、通用的 UHPLC/UV/MS 方法，用于对高效药物进行清洁验证，并建立一种更简单的鉴定未知化合物的方法。配备 UV 大光强流通池的 Agilent 1290Infinity 液相色谱系统由于光程扩展而表现出更高的信号强度。在早期研究中，使用传统 HPLC 色谱柱所进行的清洁验证研究表明，60 mm 大光强流通池的灵敏度相比于标准 10 mm 流通池提高了约 2-5 倍3,4。在此研究中我们证实了采用更快速的 UHPLC 方法获得了相似的结果。

Agilent 6150 系列单四杆质谱仪也同样适用于高灵敏度 CV 检测。安捷伦喷射流离子源 (AJS) 通过使用热鞘气将喷雾集中防止离子源中的进一步柱外电喷雾谱带展宽，与标准电喷雾离子源 (ESI) 相比，灵敏度提高多达 10 倍。AJS 离子源还适用于更宽的流速范围(20–2000 µL/min)。CV 方法所用的高流速可缩短分析时间，且不影响峰容量。AJS 离子源相比于常规 ESI 源，还能够使不同类别的化合物实现更有效的离子化。单一通用的 UHPLC/UV/MSCV 方法提高了中试规模或制造工厂的实验室工作效率5，对快速样品周转提出了更高的要求。在 CV 样品中，可能存在不同的残留化合物，例如来自当或之批次的 API、副产物、降解物、赋形剂或清洁剂。借助用户创建的质谱库，LC/UV/MS 检测还可鉴定色谱图中的未知峰。Agilent OpenLab ChemStation有利于在 NIST 质谱库搜索程序中创建附加的自定义谱库。本应用简报记录了使用 Agilent PoroshellC18 色谱柱 (3.0 × 30 mm, 2.7 µm) 针对五种常见药物开发的通用高通量UHPLC/UV/MS 方法。相比于那些全多孔颗粒填料色谱柱，这种以表面多孔颗粒填料填充的快速液相色谱柱可改善动力学性能，并且能够在 1 mL/min流速下运行 2 分钟。使用该程序，采用 UV 和 MS 相结合的方法能够对浓度范围为 0.5 ng/mL 至 1000 ng/mL 的五种模型药物的混合物进行测量。对此方法的方法性能（例如特异性、精密度、准确度、检测限 (LOD)、定量限(LOQ) 和线性）进行测定，结果发现其能够满足预期用途要求。还展示了自定义质谱库的创建及其搜索功能。该方法可能适用于各种药物的 CV，且所需的方法开发、认证和转换工作少。

实验部分开发出一种通用的 LC-UV/MS 方法并应用于五种模型药物：磺胺甲二唑、磺胺甲恶唑、心得安、丙咪嗪。尽管这些药物并不具有很高的药效，但是选择它们足以说明方法性能和系统功能。本文还展示了采用标准流通池和扩展光程 UV 流通池以及 MS-SIM/SCAN 模式对上述药物进行分析所获得的各种浓度下的线性。本研究还使用大体积进样对磺胺甲恶唑的信噪比 (S/N) 的改善程度进行了探究。表 1 显示了所开发的通用方法的仪器参数详情。

试剂与材料使用的所有溶剂和添加剂均为 LC/MS，购自 Sigma-Aldrich (Saint Louis,MO, USA)。纯水来自 Millipore 公司的Millipore Milli-Q 水纯化系统 (Billerica,MA, USA)。标样的处理在 100% 甲醇中配制浓度为 1000 µg/mL的磺胺甲二唑、磺胺甲恶唑、心得安、丙咪嗪储备液。使用50:50 [甲醇:流动相 A (MPA)] 将储备液稀释为 10 µg/mL 的工作溶液。通过连续稀释配制各种浓度的线性溶液。浓度 (ng/mL) 分别为：0.2、0.3、0.5、1、5、10、20、30、50、100、500、1000、2000、5000 和 10000。

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结果与讨论UHPLC/UV 检测在该通用 UHPLC/UV 方法中使用配备高灵敏度大光强 60 mm 流通池或标准 10 mm 流通池的 Agilent 1290 Infinity二管阵列检测器（表 1）。在使用10 mm 流通池的情况下，将五种化合物的混合物重复进样六次所获得的色谱图进行叠加（图 1）。使用两种流通池进行浓度高为 10000 ng/mL 的线性实验。就磺胺甲二唑而言，使用高灵敏度流通池和标准流通池分别得到5 ng/mL 和 20 ng/mL 的 LOQ。正如预料，采用高灵敏度流通池得到的检测限比采用 10 mm 流通池得到的检测限低 3-4 倍。这些结果与早期研究相差无几2。采用两种流通池得到的 LOD/LOQ 浓度范围如表 2 所示。使用 UV 检测器和标准流通池可获得 20-50 ng/mL的 LOQ。在该线性范围研究中，处于实验浓度水平的化合物的线性表明相关系数 R2 > 0.99（图 2）。

发现 LOQ 下的峰面积和保留时间的RSD 分别小于 5% 和 0.1%（表 3）。实验浓度下所有化合物的线性均表现出线性相关系数或 R2 > 0.98（图 4）。采用 1/x 的加权因子2 由线性方程推算出的准确度值处于 15% 以内（表 4）。还将单离子监测 (SIM) 方法所获得的LOQ 同 MS 扫描数据进行了比较，其中 SIM 和全扫描数据在同一次运行中进行采集。来自全扫描数据的化合物提取离子色谱图 (EIC) 的 LOQ 对于所有化合物均为 5 ng/mL（数据未示出），表明 SIM 模式的灵敏度比全扫描模式高大约 10 倍。用于 LC/MS 运行的大体积进样研究了在高灵敏度 CV 方法中使用大体积进样获得更低 LOQ 的可能性。这对于需要更高灵敏度的情况十分有用。大体积进样可提高峰面积和 S/N，但是可能增加谱峰展宽。这可能并非 CV测定中主要关心的问题，因为在实际CV 样品溶液中很少观察到与多种 API相关的峰。使用该通用方法获得的三种不同浓度的磺胺甲恶唑的大体积进样结果如表 5 所示。结果表明，在30 mm 色谱柱上，当进样量由 5 µL 增加至 12 µL 时，峰面积、峰宽和 S/N分别提高了 57%、31% 和 41%。磺胺甲恶唑研究表明，采用更高体积的进样 (10 µL) 能够使灵敏度再提高 2 倍。在本研究所用的 3 mm 色谱柱上，采用 12 µL 以上的大体积进样将导致谱峰分裂。

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结论高效药物的 CV 需要采用高灵敏度和高通量方法。本研究开发出了一种用于 CV 的 2 分钟通用方法，并采用五种常见药物对其进行了验证，结果展示了该方法在此应用中的性能。使用UV 和 MS (SIM) 检测分别可获得 20-50 ng/mL 和 0.5 ng/mL 的 LOQ。使用大光强 UV 流通池和大体积进样可进一步改善该方法，其灵敏度可分别提高 2-4 倍和 2 倍（使用 10 µL 的进样量）。Agilent 1290 Infinity UHPLC与配备安捷伦喷射流离子源 (AJS) 的Agilent 6150 单四杆质谱仪在 SIM 或SCAN 模式下运行，为 CV 研究提供了一种通用的工具，适用于对来自生产设备的冲洗溶液进行定量分析。此外，通过搜索用户补充的质谱库可轻松鉴定未知化合物。

原创作者：上海斯迈欧分析仪器有限公司