摘要：本应用简报介绍了一种简便而快速的方法，其采用经改良的光电倍增管 (PMT) 的荧光检 测器 (FLD) 来分析特初榨橄榄油 (EVOO) 中叶绿素热降解产物脱镁叶绿素 (PP) 和原焦 脱镁叶绿素 (PPP)。采用 Hamamatsu R928HA 红敏 PMT 代替标准 PMT，可以将原始信 号提高约 120 倍。另外，由于基线噪音的降低，总体分析性能提高了 180 倍。本方法对 稀释的 EVOO 直接进行分析，无需进行其他的样品处理，与传统标准组织 (ISO) 的 固相萃取 (SPE)/紫外检测 (UV) 方法相比，该方法不仅降低溶剂消耗量和缩短液相色谱循 环时间，分离度也得到了提高。

言 EVOO 是采用机械方法从橄榄 (Olea europaea L.) 中获得的。叶绿 素是存在于 EVOO 中的天然绿色色素，已证明其在加工和储存过 程中易于降解为脱镁叶绿素和原焦脱镁叶绿素。在果实研磨和打 浆过程中，叶绿素受酸性条件和加热的影响尤为明显，各成分的密 切接触，往往会释放出酸性化合物，导致大幅度的叶绿素脱镁反 应 [1]。因此可使用叶绿素降解产物作为 EVOO 的一个质量参数。 ISO 的 PPP 分析方法作为橄榄油标准的一部分，于 2010 年被澳 大利亚和新西兰采用，而其他国家尚待采用。根据所获得的数值 可确定 EVOO 的保存是否得当，或者 EVOO 是否掺杂了精炼橄 榄油。 ISO 29841 中的传统 SPE/UV 方法包括几个样品处理步骤，这 些步骤会耗费大量的溶剂和时间。在改良的 FLD 方法中，采用异 丙醇稀释橄榄油样品后即可进行 HPLC 进样分析。采用四元溶 剂梯度方法，通过四元梯度泵进行第四种强溶剂（四氢呋喃）冲 洗，不需要对任何溶剂进行预混合，而且还大大减少了次分析 在色谱柱上残留的橄榄油。此外，采用在红光区更敏感的 PMT 代 替标准 PMT，使 FLD 灵敏度提高了 180 倍。

实验部分 仪器配置 ISO 29841 SPE/UV 方法 Agilent 1290 Infinity 二元液相色谱系统，由化学工作站（版本 C.01.03 [44]）控制，含以下模块：二管阵列检测器 (DAD) 作为 原始 ISO 方法的 UV 检测器。 • Agilent 1290 Infinity 二元泵 (G4220A) • Agilent 1290 Infinity 自动进样器 (G4226A) • Agilent 1290 Infinity 柱温箱 (G1316C) • Agilent 1290 Infinity 二管阵列检测器 (G4212A) 改良的 FLD 方法 Agilent 1260 Infinity 四元液相色谱系统，由化学工作站（版本 C.01.03 [44]）控制，含以下模块： • Agilent 1260 Infinity 四元泵 (G4204A) • Agilent 1290 Infinity 自动进样器 (G4226A) • Agilent 1290 Infinity 柱温箱 (G1316C) • Agilent 1260 Infinity 荧光检测器 (G1321B)，配置 Hamamatsu R928HA PMT

样品处理 所有溶剂均为液相色谱（与液相色谱条件中相同）。新制 Milli-Q 水来自配置 0.22 µm 膜式终端过滤器 (Millipak) 的 Milli-Q Integral 水纯化系统。 ISO SPE/UV 方法 将约 300 mg 橄榄油样品溶解在 1 mL 石油醚中，充分涡旋混合。 将样品溶液注入 1000 mg/6 mL 硅胶小柱（Phenomenex，美国 加利福尼亚州托伦斯）上，用每份 1 mL的石油醚淋洗两次。一旦 溶剂在柱填料顶部排干，用 5 mL的石油醚/乙mi（90:10，v/v） 洗脱非性物质两次，并弃去。然后，用 5 mL丙酮洗脱脱氧叶绿素 组分，将其收集到一支 10 mL 玻璃试管中，用锡箔盖封（避光）。 用旋转蒸发器在高 20 °C 下蒸干溶剂，再用 1 mL 丙酮复溶，以 进行下一步 HPLC 分析 [2]。

良的 FLD 方法 取 200 mg 的橄榄油样品溶解在 1 mL 异丙醇溶剂中，涡旋混合 15 。

结果与讨论 图 1 显示了两种 ISO 样品处理和检测方案得到的叠加色谱图， 这两种样品处理和检测图解分别为 SPE/UV（蓝色）和稀释/FLD （红色），并使用针对稀释/FLD 新开发的改良色谱条件。两种方法 得到的 PPP 值均为 15%（根据公式 1 计算）。两种样品处理方 法都显示出了良好的 HPLC 分离度，脱氧叶绿素 a 和脱氧叶绿素 a’ 的分离度比 ISO 法色谱条件有了明显改善。
 

SO SPE/UV 方法的样品处理时间为 30 分钟，HPLC 分析时间 为 40 分钟或更长。而采用改良后的 UHPLC/FLD 方法，配置 3.0 × 100 mm C18 柱的四元系统，稀释步骤非常短暂，分析时间缩短 到 25 分钟。与标准 ISO 条件相比，UHPLC 分析的溶剂消耗量和 总分析时间只有原来的 40% 或更少。这表明分析成本和时间显著 减少，而且还提高了低含量样品的灵敏度。 % PPP = 100 × Appp/(App + Appp) 其中， % PPP = % 橄榄油样品中原焦脱镁叶绿素的 % 含量 Appp = 原焦脱镁叶绿素 a 的峰面积 App = 脱镁叶绿素 a 和脱镁叶绿素 a’ 的总峰面积 公式 1. 橄榄油中 PPP 含量的计算

结论 实验证明，与传统的 ISO SPE/UV 方法相比，改良的 FLD 方法是 一种更有景的选择。在本实验中，用 R928HA 红敏光电倍增管 取代标准 PMT 后，可以检测低含量的 PPP 样品。从而在时间、 人力、SPE 材料和溶剂消耗量等方面，为那些多样品分析的实 验室节省了大量的成本。
 

原创作者：上海斯迈欧分析仪器有限公司