维生素D是一种脂溶性维生素，其具有促进生长和骨骼钙化，促进牙齿健全、用于治疗佝偻病、骨软化症等功能作用，是一种大家广为熟知的营养元素。《中国药典》2020年版《0722维生素D测定法》，保留原先的、二、三法外，新增加了第四法——柱切换二维液相法。

本次，小编和您一起探讨新加入的第四法。

 什么是柱切换二维液相法？

柱切换二维液相法是将不同选择性分离柱组合，加强分离能力的联用技术。柱切换液相色谱系统通常由维分离柱和第二维分离柱串联组成，两柱之间以切换阀作为接口，通过流动相流路的改变，将部分或全部维柱流出的组分，导入第二维柱进行二次分离，从而起到净化目标化合物，提高系统分离能力的作用。如果只是将部分组分导入第二维柱分析，通常又称为中心切割二维液相法，用LC+LC表示；如果是全部组分全部导入第二维柱，通常称为全二维液相色谱法，用LC×LC表示。

 新增加的第四法，优点有哪些？

《中国药典》2020年版四部《0722维生素D测定法》，采用高效液相色谱法测定维生素D制剂中所含维生素D含量，以及维生素AD制剂或鱼肝油中所含维生素D及前维生素D（折算成维生素D）的总量。

•当待测药品中无维生素A及其他杂质干扰可用法测定，否则应按第二法处理后测定；

•如果按第二法处理后，前维生素D峰仍受杂质干扰，仅有维生素D峰可以分离时，则应按第三法测定，或不经前处理按第四法测定。第二法和第三法的供试液制备需要采用“正相收集、反相洗脱”，第三法为了进一步去除前维生素D峰的杂质干扰，还增加了水浴加热再净化的过程，前处理较为麻烦，一个实验常常需要2~3天时间来完成；

•第四法通过在线净化的方式，省去了复杂的前处理步骤，让仪器来代替复杂的人工操作！且相比较而言，第四法的仪器配置更为简单，是药品中维生素D检测的不错选择！

 岛津应对方案

该方案在岛津中心切割二维液相系统上进行。系统配置包括一维二元高压系统和二维四元低压系统，两个紫外检测器，一个进样单元和一个柱温箱；柱温箱中装载两根不同性能的色谱柱，并通过加载一个高压流路切换阀实现一维和二维的实时切换。

图1. 岛津二维液相（中心切割）系统

 01 前处理：

按照《中国药典》2020年版四部通则0722维生素D测定法第四法要求进行制备。

 02 分析条件：

维色谱柱：HILIC-10（2.1x150 mm，3 μm）

第二维色谱柱：RX-SIL（3.0x100 mm，1.8 μm）

维流动相：A相：正己烷；

B相：正己烷-正戊烷-异丙醇（98：1：1）；

按下表程序进行梯度洗脱

第二维流动相：正己烷-正戊醇-异丙醇（996：2：2），等度洗脱

流速：0.5 mL/min               

进样体积：100 μL

柱温：40℃                            

检测波长：265 nm

收集管：聚醚醚酮（peek）管，内径0.0762 cm（0.03英寸），20 m，容积约9 mL

 03 对照品溶液色谱图：

取方法中的校正因子f2上机测试，得到对照品溶液色谱图。其中维液相维生素D的理论塔板数超过2500，与前维生素D的分离度＞5；各峰的重复性为0.76%~1.46%（n=5），均满足药典的要求。

图2. 对照品溶液维色谱图（上）和第二维色谱图（下）

 04 供试品溶液色谱图：

取制备好的供试品溶液上机分析。在维色谱图中，由于维生素A醇和油脂的干扰，前维生素D被大量杂质峰包裹，无法检测；将该时间段的物质切入第二维色谱中继续分析，前维生素D和维A醇、油脂等杂质在第二维色谱图中得到了有效的分离。

图3. 供试品溶液维色谱图（上）和第二维色谱图（下）

 05 参与验标工作：

岛津广州分析中心参与了该方法的验标工作；制标专家和岛津工程师共同建立并验证了方法，方法可靠、稳定，可有效地应对《中国药典》0722通则第四法柱切换色谱法。