荧光定量ＰＣＲ　实验步骤：

 

①取冻存已裂解的细胞，室温放置５分钟使其溶解。

 

②两相分离　每１ｍｌ的ＴＲＩＺＯＬ试剂裂解的样品中加入０．２ｍｌ的，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体１５后，１５到３０℃孵育２到３分钟。４℃下１２０００ｒｐｍ离心１５分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚相，中间层以及无色水相上层。ＲＮＡ全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的ＴＲＩＺＯＬ试剂的６０％。

 

③ＲＮＡ沉淀　将水相上层转移到一干净无ＲＮＡ酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的ＲＮＡ，混匀后１５到３０℃孵育１０分钟后，于４℃下１２０００ｒｐｍ　离心１０分钟。此时离心不可见的ＲＮＡ沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。

 

④ＲＮＡ清洗　移去上清液，每１ｍｌＴＲＩＺＯＬ试剂裂解的样品中加入至少１ｍｌ的７５％乙醇（７５％乙醇用ＤＥＰＣＨ２Ｏ配制），清洗ＲＮＡ沉淀。混匀后，４℃下７０００ｒｐｍ离心５分钟。

 

⑤ＲＮＡ干燥　小心吸去大部分乙醇溶液，使ＲＮＡ沉淀在室温空气中干燥５－１０分钟。

 

⑥溶解ＲＮＡ沉淀　溶解ＲＮＡ时，先加入无ＲＮＡ酶的水４０μｌ用枪反复吹打几次，使其溶解，获得的ＲＮＡ溶液保存于－８０℃待用。　１）紫外吸收法测定

 

先用稀释用的ＴＥ溶液将分光光度计调零。然后取少量ＲＮＡ溶液用ＴＥ稀释（１：１００）后，读取其在分光光度计２６０ｎｍ和２８０ｎｍ处的吸收值，测定ＲＮＡ溶液　浓度和纯度。

 

①　浓度测定

 

Ａ２６０下读值为１表示４０　μｇ　ＲＮＡ／ｍｌ。样品ＲＮＡ浓度（μｇ／ｍｌ）计算公式为：Ａ２６０　×稀释倍数×　４０　μｇ／ｍｌ。具体计算如下：

 

ＲＮＡ溶于４０　μｌ　ＤＥＰＣ水中，取５ｕｌ，１：１００稀释至４９５μｌ的ＴＥ中，测得Ａ２６０　＝　０．２１

 

ＲＮＡ　浓度＝　０．２１　×１００　×４０　μｇ／ｍｌ　＝　８４０　μｇ／ｍｌ　或　０．８４　μｇ／μｌ

 

取５ｕｌ用来测量以后，剩余样品ＲＮＡ为３５　μｌ，剩余ＲＮＡ总量为：

 

３５　μｌ　×　０．８４　μｇ／μｌ　＝　２９．４　μｇ

 

②纯度检测

 

ＲＮＡ溶液的Ａ２６０／Ａ２８０的比值即为ＲＮＡ纯度，比值范围１．８到２．１。

 

２）变性琼脂糖凝胶电泳测定

 

①制胶

 

１ｇ琼脂糖溶于７２ｍｌ水中，冷却至６０℃，１０　ｍｌ的１０×　ＭＯＰＳ电泳缓冲液和１８　ｍｌ的３７％　甲醛溶液（１２．３　Ｍ）。

 

１０×ＭＯＰＳ电泳缓冲液

 

浓度　成分

 

０．４Ｍ　ＭＯＰＳ，ｐＨ　７．０

 

０．１Ｍ　乙酸钠

 

０．０１Ｍ　ＥＤＴＡ

 

灌制凝胶板，预留加样孔至少可以加入２５　μｌ溶液。胶凝后取下梳子，将凝胶板放入电泳槽内，加足量的１×ＭＯＰＳ电泳缓冲液至覆盖胶面几个毫米。

 

②准备ＲＮＡ样品

 

取３μｇＲＮＡ，加３倍体积的甲醛上样染液，加ＥＢ于甲醛上样染液中至终浓度为１０μｇ／ｍｌ。加热至７０℃孵育１５分钟使样品变性。

 

③电泳

 

上样凝胶须预电泳５ｍｉｎ，随后将样品加入上样孔。５–６Ｖ／ｃｍ电压下２ｈ，电泳至溴酚兰指示剂进胶至少２–３ｃｍ。

 

④紫外透射光下观察并拍照

 

２８Ｓ和１８Ｓ核糖体ＲＮＡ的带非常亮而浓（其大小决定于用于抽提ＲＮＡ的物种类型），上面一条带的密度大约是下面一条带的２倍。还有可能观察到一个更小稍微扩散的带，它由低分子量的ＲＮＡ（ｔＲＮＡ和５Ｓ核糖体ＲＮＡ）组成。在１８Ｓ和２８Ｓ核糖体带之间可以看到一片弥散的ＥＢ染色物质，可能是由ｍＲＮＡ和其它异型ＲＮＡ组成。ＲＮＡ制备过程中如果出现ＤＮＡ污染，将会在２８Ｓ核糖体ＲＮＡ带的上面出现，即更高分子量的弥散迁移物质或者带，ＲＮＡ的降解表现为核糖体ＲＮＡ带的弥散。用数码照相机拍下电泳结果。　①反应体系　序号　反应物　剂量　１　逆转录ｂｕｆｆｅｒ　２μｌ　２　上游引物　０．２μｌ　３　下游引物　０．２μｌ　４　ｄＮＴＰ　０．１μｌ　５　逆转录酶ＭＭＬＶ　０．５μｌ　６　ＤＥＰＣ水　５μｌ　７　ＲＮＡ模版　２μｌ　８　总体积　１０μｌ　轻弹管底将溶液混合，６０００ｒｐｍ短暂离心。

 

②混合液在加入逆转录酶ＭＭＬＶ　之先７０℃干浴３分钟，取出后立即冰水浴至管内外温度一致，然后加逆转录酶０．５μｌ，３７℃水浴６０分钟。

 

③取出后立即９５℃干浴３分钟，得到逆转录终溶液即为ｃＤＮＡ溶液，保存于－８０℃待用。　管家基因（β－ａｃｔｉｎ）实时定量ＰＣＲ

 

①β－ａｃｔｉｎ阳性模板的标准梯度制备　阳性模板的浓度为１０１１，反应取３μｌ按１０倍稀释（加水２７μｌ并充分混匀）为１０１０，依次稀释至１０９、１０８、１０７、１０６、１０５、１０４，以备用。

 

②反应体系如下：

 

标准品反应体系　序号　反应物　剂量　１　ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　１　染料　１０μｌ　２　阳性模板上游引物Ｆ　０．５μｌ　３　阳性模板下游引物Ｒ　０．５μｌ　４　ｄＮＴＰ　０．５μｌ　５　Ｔａｑ酶　１μｌ　６　阳性模板ＤＮＡ　５μｌ　７　ｄｄＨ２Ｏ　３２．５μｌ　８　总体积　５０μｌ　轻弹管底将溶液混合，６０００ｒｐｍ短暂离心。

 

管家基因反应体系：　序号　反应物　剂量　１　ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　１　染料　１０μｌ　２　内参照上游引物Ｆ　０．５μｌ　３　内参照下游引物Ｒ　０．５μｌ　４　ｄＮＴＰ　０．５μｌ　５　Ｔａｑ酶　１μｌ　６　待测样品ｃＤＮＡ　５μｌ　７　ｄｄＨ２Ｏ　３２．５μｌ　８　总体积　５０μｌ　轻弹管底将溶液混合，６０００ｒｐｍ短暂离心。

 

③制备好的阳性标准品和检测样本同时上机，反应条件为：９３℃２分钟，然后９３℃　１分钟，５５℃　２分钟，共４０个循环。　①针对每一需要测量的基因，选择一确定表达该基因的ｃＤＮＡ模板进行ＰＣＲ反应。

 

反应体系：　序号　反应物　剂量　１　１０×ＰＣＲ缓冲液　２．５　ｕｌ　２　ＭｇＣｌ２溶液　１．５　ｕｌ　３　上游引物Ｆ　０．５　ｕｌ　４　下游引物Ｒ　０．５　ｕｌ　５　ｄＮＴＰ混合液　３　ｕｌ　６　Ｔａｑ聚合酶　１　ｕｌ　７　ｃＤＮＡ　１　ｕｌ　８　加水至总体积为　２５ｕｌ　轻弹管底将溶液混合，６０００ｒｐｍ短暂离心。

 

３５个ＰＣＲ循环（９４℃１分钟；５５℃１分钟；７２℃１分钟）；　７２℃延伸５分钟。

 

②ＰＣＲ产物与　ＤＮＡ　Ｌａｄｄｅｒ在２％琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，检测ＰＣＲ产物是否为单一特异性扩增条带。

 

③将ＰＣＲ产物进行１０倍梯度稀释：　设定ＰＣＲ产物浓度为１×１０１０，依次稀释至１０９、１０８、１０７、１０６、１０５、１０４几个浓度梯度。　①所有ｃＤＮＡ样品分别配置实时定量　ＰＣＲ反应体系。

 

体系配置如下：　序号　反应物　剂量　１　ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　１　染料　１０　ｕｌ　２　上游引物　１ｕｌ　３　下游引物　１ｕｌ　４　ｄＮＴＰ　１ｕｌ　５　Ｔａｑ聚合酶　２ｕｌ　６　待测样品ｃＤＮＡ　５ｕｌ　７　ｄｄＨ２Ｏ　３０ｕｌ　８　总体积　５０　ｕｌ　轻弹管底将溶液混合，６０００ｒｐｍ短暂离心。

 

②将配制好的ＰＣＲ反应溶液置于Ｒｅａｌｔｉｍｅ　ＰＣＲ仪上进行ＰＣＲ扩增反应。反应条件为：９３℃２分钟预变性，然后按９３℃　１分钟，５５℃１分钟，７２℃１分钟，共４０做个循环，７２℃７分钟延伸。　各样品的目的基因和管家基因分别进行Ｒｅａｌｔｉｍｅ　ＰＣＲ反应。ＰＣＲ产物与　ＤＮＡ　Ｌａｄｄｅｒ在２％琼脂糖凝胶电泳，ＧｏｌｄＶｉｅｗ染色，检测ＰＣＲ产物是否为单一特异性扩增条带。

 

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