人Ⅳ型胶原(Col Ⅳ)elisa试剂盒实验方案

　　人Ⅳ型胶原试剂盒操作注意事项:

　　1、试剂应按标签说明书储存，使用恢复到室温。稀稀过后的标准品应丢弃，不可保存。

　　2、实验中不用的板条应立即放回包装袋中，密封保存，以免变质。不用的其它试剂应包装好或盖好。

　　3、不同批号的试剂不要混用。

　　4、人Ⅳ型胶原试剂盒保质使用。

　　5、使用次性的吸头以免交叉污染，吸取终止液和底物A、B液时，避免使用带金属部分的加样器。

　　6、使用干净的塑料容器配置洗涤液。使用充分混匀试剂盒里的各种成份及样品。洗涤酶标板时应充分拍干，不要将吸水纸直接放入酶标反应孔中吸水。底物A应挥发，避免长时间打开盖子。底物B对光敏感，避免长时间暴露于光下。避免用手接触，有毒。

　　7、实验完成后应立即读取OD值。加入试剂的顺序应致，以保证所有反应板孔温育的时间样。按照说明书中标明的时间、加液的量及顺序进行温育操作。人Ⅳ型胶原试剂盒样品收集、处理及保存方法:

　　1、血清－－－－-操作过程中避免任何细胞刺激。使用不含热原和内毒素的试管。收集血液后，1000×g离心10分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。

　　2、血浆－－－－-EDTA、柠檬酸盐、肝素血浆可用于检测。1000×g离心30分钟去除颗粒。细胞上清液－－-1000×g离心10分钟去除颗粒和聚合物。

　　3、组织匀浆－－－－-将组织加入适量生理盐水捣碎。1000×g离心10分钟。

　　4、取上清液保存－－－－－－如果样品不立即使用，应将其分成小部分-70 ℃保存，避免反复冷冻。

　　注意：尽可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中大量颗粒，检测先离心或过滤。不要在37℃或更高的温度加热解冻。应在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。

　　人Ⅳ型胶原试剂盒操作:

　　人Ⅳ型胶原试剂盒使用，将所有试剂充分混匀。不要使液体产生大量的泡沫，以免加样时加入大量的气泡，产生加样上的误差。根据待测样品数量加上标准品的数量决定所需的板条数。每个标准品和空白孔建议做复孔。每个样品根据自己的数量来定，能使用复孔的尽量做复孔。

　　标本用标本稀释液1：1稀释后加入50ul于反应孔内。加入稀释好后的标准品50ul于反应孔、加入待测样品50ul于反应孔内。立即加入50ul的生物素标记的抗体。盖上膜板，轻轻振荡混匀，37℃温育1小时。甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作3次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加次。每孔加入80ul的亲和链酶素-HRP，轻轻振荡混匀，37℃温育30分钟。甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作3次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加次。每孔加入底物A、B各50ul，轻轻振荡混匀，37℃温育10分钟。避免光照。取出酶标板，迅速加入50ul终止液，加入终止液后应立即测定结果。在450nm波长处测定各孔的OD值。局限6号标准品以上的结果为非线性的，根据此标准曲线无法得到精确的结果。

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