实验分享 | 免疫组织化学技术(原理、材料与仪器、步骤)

　　原理

　　带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜(包括荧光显微镜、电子显微镜)的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质(如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等)。

　　材料与仪器

　　切片

　　细胞通透液 乙醇 蒸馏水 双氧y水 Triton X-100 羊血清 DAB Xylene 苏木j染液 双蒸水 中性树胶

　　微波炉 吹风机 组化笔 湿盒 烤箱 振荡器 染缸 光学显微镜 纯木浆卫生纸 计时器 通风橱

　　步骤

　　一. 试剂配制

　　1. 0.01 M PBS(pH 7.34 )

　　9.0 g NaCl + 50 ml 0.2 M PB加双蒸水至1000 ml;1000 ml 0.2 M PB (pH 7.4)=5.93 g NaH2PO4·2H2O+58.02 g Na2HPO4·12H2O in 1000 ml双蒸水或=190 ml A + 810 ml B(A. 0.2 M NaH2PO4·2H2O：15.6 g in 500 ml ddH2O;B. 0.2 M Na2HPO4·12H2O：71.632 g in 1000 ml dH2O)。

　　2. Citrate Buffered Saline(0.01 M柠檬酸缓冲液，pH6.0)

　　28 ml A + 72 ml B + 200 ml ddH2O(A.Citrate acid(柠檬酸)：10.5 g 加双蒸水至1000 ml;B.Citrate sodium(柠檬酸钠)：29.41 g加双蒸水至1000 ml)。

　　3. 细胞通透液

　　由终浓度分别为0.3%双y水和0.3%Triton X-100混合而成。配制方法是先用微波加热的36 ml PBS，再接着加120 ul TritonX-100，并加热一会儿，冷却至临用加0.4 ml 30%H2O2。

　　4. 5%羊血清或封闭血清，用PBS稀释。

　　5. 含0.03%H2O2的0.05%DAB(避光)：用20×DAB(1%，10 mg/ml)5 ul+0.1 ul 30% H2O2+95 ul PBS。

　　6. 一抗、二抗均用PBS稀释。

　　7. Xylene、梯度Ethanol(100%x2、95%、80%、70%、50%)、双蒸水、中性树胶(封裱剂)。

　　8. 苏木j染液

　　二. 操作步骤

　　1. 脱蜡、水化

　　(1)60 ℃x20 min→Xylene 2 x10 minutes;

　　(2)100% absolute ethanol：2 x5 minutes;

　　(3)95% ethanol 2 minutes;

　　(4)80% ethanol 2 minutes;

　　(5)70% ethanol 2 minutes;

　　(6) distilled water：5 min;

　　(7)PBS洗3次x3 min。

　　2、细胞通透、封闭内源性过氧化物酶

　　(1)用封闭通透液浸润切片30 min(RT避光)。配法是用预热40 ml PBS加120 ul TritonX-100加热几分钟后，临用加400 ul 30%H2O2。

　　(2) PBS溶液洗3次x3 min。

　　3、抗原修复暴露抗原决定族

　　(1) 切片放入0.01 M柠檬酸钠缓冲溶液(pH6.0)后，在微波炉里高火4 min至沸腾后，再加热约6 minx4次，每次间隔补足液体，防止干片。

　　4、封闭非特异性蛋白

　　(1) PBS溶液洗3次x3 min;

　　(2)将切片取出，周围水分用滤纸吸干,用组化笔在组织周围画上圈,在圆圈内组织滴入5%羊血清(与二抗来源一致)后放入湿盒中,室温30(10～30)min;

　　5、一抗孵育

　　(1) 甩去切片上的羊血清,用滤纸擦干组织周围残留血清，直接加入已稀释的一抗(1：250、500、1000)后，放入湿盒中室温1小时，然后4度过夜，从冰箱中取出需37 ℃复温45 min。

　　6、二抗孵育

　　(1)将一抗倒掉并用PBS洗5 minx5次;

　　(2) 用滤纸将圆圈周围的水吸去，加入已稀释的二抗后放入37 ℃恒温烤箱中30 min(回收)。

　　(3)用PBS洗5次x5 min;

　　7、SP反应

　　(1) 加入SP后放入37度烤箱中30 min。

　　(2) 用PBS洗5次x5 min;

　　8、显色

　　(1)加入DAB(快速滴入，观察染色情况，倒掉染液)，显色时间控制在约5 min(3～10 min)，由镜下观察颜色控制时间。

　　0.05%DAB(避光)(1：20储备液)：5 ul 20xDAB+0.1 ul 30% H2O2+95 ul PBS。1%DAB储备液的配制：50 mg DAB+5 ml 0.05 mol/L PBS充分溶解，-20 ℃保存。

　　9、复染、脱水、透明、封片

　　(1)用PBS 3次x3min后，用双蒸水洗5 min;

　　(2)加一大滴苏木素染液，胞核蛋白染几，胞浆或胞膜蛋白染20 s后自来水冲洗，双蒸水洗5 min，再用PBS返蓝5 min。

　　(3)脱水

　　(4)透明

　　Xylene 1x(1-2) min→Xylene 2x(1-2) min

　　(5) 封片

　　中性树胶。

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