人组织蛋白酶D(cath-D)ELISA试剂盒方法描述

　　人组织蛋白酶D(cath-D)是一种溶酶体天冬氨酸蛋白酶，具有降解蛋白质和激活溶酶体室中生物活性蛋白体的功能。为了准确、灵敏地检测人组织蛋白酶D的含量，我们采用了双抗体夹心法的ELISA试剂盒。下面将详细介绍该试剂盒的方法描述。

　　一、实验原理 本试剂盒采用双抗体夹心法测定标本中人组织蛋白酶D(CTSD)水平。先，用纯化的人组织蛋白酶D(CTSD)捕获抗体包被微孔板，制成固相抗体。然后，往包被的微孔中依次加入人组织蛋白酶D(CTSD)，再与HRP标记的检测抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物。经过洗涤后，加入底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成终的黄色。颜色的深浅和样品中的人组织蛋白酶D(CTSD)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值)，通过标准曲线计算样品中人组织蛋白酶D(CTSD)含量。

　　二、实验步骤

　　1. 包被：用0.05MPH9.6的碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg/ml。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。

　　2. 加标本：加标本需将标本进行适当稀释，一般使用微量加样器按规定的量加入板孔中。注意每次加标本应更换吸嘴，以免发生交叉污染。加样过程中应避免产生气泡，以免影响实验结果。

　　3. 温育：加入标本后，进行温育。温育温度和时间对实验结果有重要影响，一般需在37℃恒温箱中温育1小时。

　　4. 加酶结合物：温育结束后，弃去孔内液体，用洗涤缓冲液洗3次。然后加入酶结合物，再次进行温育。

　　5. 显色：温育结束后，弃去孔内液体，用洗涤缓冲液洗3次。然后加入底物TMB，避光显色。

　　6. 终止：显色一定时间后，加入终止液终止反应。此时，孔内液体颜色由蓝色转为黄色。

　　7. 测定：用酶标仪在450nm波长下测定各孔OD值。注意测定需将酶标仪预热，并使用空白孔调零。

　　三、结果计算与分析 根据测定的OD值，通过标准曲线计算样品中人组织蛋白酶D(CTSD)含量。标准曲线一般通过绘制不同浓度标准品的OD值绘制而成。通过比较样品OD值与标准曲线上的OD值，即可计算出样品中人组织蛋白酶D(CTSD)的含量。

　　四、注意事项

　　1. 实验中使用的所有试剂和器材应严格按照说明书要求进行准备和操作。

　　​注：以上资料仅供参考!

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原创作者：本生（天津）健康科技有限公司