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技术文章
鸡25 羟维生素D （25 （OH ）VD ） 酶联免疫
点击次数：6963 发布时间：2019/8/1 13:53:31
鸡25 羟维生素D （25 （OH ）VD ） 酶联免疫鸡25 羟维生素D （25 （OH ）VD ） 酶联免疫 分析
试剂 盒使用说明书
本试剂盒仅供研究使用。
检测范围 ： 96T
0.3ng/ml - 12ng/ml
使用目的 ：
本试剂盒用于测定鸡血清、血浆及相关液体样本中 25 羟维生素 D（25（OH）VD）含
量。
实验原理
本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中鸡 25 羟维生素 D（25（OH）VD）水平。用纯
化的鸡 25（OH）VD 抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入 25（OH）
VD，再与 HRP 标记的 25（OH）VD 抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底
洗涤后加底物 TMB 显色。TMB 在 HRP 酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成*
终的黄色。颜色的深浅和样品中的 25（OH）VD 呈正相关。用酶标仪在 450nm 波长下测定
吸光度（OD 值），通过标准曲线计算样品中鸡 25 羟维生素 D（25（OH）VD）浓度。
试剂盒组成
1 30 倍浓缩洗涤液 20ml×1 瓶 7 终止液 6ml×1 瓶
2 酶标试剂 6ml×1 瓶 8 标准品（24ng/ml） 0.5ml×1 瓶
3 酶标包被板 12 孔×8 条 9 标准品稀释液 1.5ml×1 瓶
4 样品稀释液 6ml×1 瓶 10 说明书 1 份
5 显色剂 A 液 6ml×1 瓶 11 封板膜 2 张
6 显色剂 B 液 6ml×1/瓶 12 密封袋 1 个
标本 要求
1．标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能
马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融
2．不能检测含 NaN3 的样品，因 NaN3 抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。
操作步骤
1. 标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照下列图表在小试管中进行稀
释。
12ng/ml 5 号标准品 150µl 的原倍标准品加入 150µl 标准品稀释液
6.0ng/ml 4 号标准品 150µl 的 5 号标准品加入 150µl 标准品稀释液
3.0ng/ml 3 号标准品 150µl 的 4 号标准品加入 150µl 标准品稀释液
1.5ng/ml 2 号标准品 150µl 的 3 号标准品加入 150µl 标准品稀释液
0.75ng/ml 1 号标准品 150µl 的 2 号标准品加入 150µl 标准品稀释液
2. 加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔、
待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样 50µl，待测样品孔中先加样品稀释液 40µl，
然后再加待测样品 10µl（样品*终稀释度为 5 倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽
量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。
3. 温育：用封板膜封板后置 37℃温育 30 分钟。
4. 配液：将 30 倍浓缩洗涤液用蒸馏水 30 倍稀释后备用
5. 洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置 30 秒后弃去，如此
重复 5 次，拍干。
6. 加酶：每孔加入酶标试剂 50µl，空白孔除外。
7. 温育：操作同 3。
8. 洗涤：操作同 5。
9. 显色：每孔先加入显色剂 A50µl，再加入显色剂 B50µl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色
10 分钟.
10. 终止：每孔加终止液 50µl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。
11. 测定：以空白空调零，450nm 波长依序测量各孔的吸光度（OD 值）。 测定应在加终止
液后 15 分钟以内进行。
操作程序总结 ：
计算
以标准物的浓度为横坐标，OD 值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的
OD 值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与 OD 值计算出标
准曲线的直线回归方程式，将样品的 OD 值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，
即为样品的实际浓度。
注意事项
1．试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡 15-30 分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未
用完，板条应装入密封袋中保存。
2．浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。
3．各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差。一次加样时间
控制在 5 分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。
4． 请每次测定的同时做标准曲线，做复孔。如标本中待测物质含量过高（样本 OD 值
大于标准品孔孔的 OD 值），请先用样品稀释液稀释一定倍数（n 倍）后再测定，计
算时请*后乘以总稀释倍数（×n×5）。
5． 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。
6．底物请避光保存。
7．严格按照说明书的操作进行，试验结果判定必须以酶标仪读数为准.
8．所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。
9．本试剂不同批号组分不得混用。
保存条件及有效期
1．试剂盒保存：；2-8℃。
2．有效期：6 个月
原创作者：上海瑞番生物科技有限公司
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