产品名称：脱氢抗坏血酸还原酶（DHAR）活性测试盒

规格：50管/48样   ：100管/96样 

产品内容： 

试剂一：液体×1瓶，4℃保存。

试剂二：液体×1瓶，4℃保存。

试剂三：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前加5 mL蒸馏水溶解。

自备仪器和用品：

紫外分光光度计、低温离心机、水浴锅、可调节移液器、1mL石英比色皿和蒸馏水。

操作步骤：

一、粗酶液提取：

1.      组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL试剂一）进行冰浴匀浆。8000g，4℃离心10min，取上清置冰上待测。

2.      细菌、真菌：按照细胞数量（104个）：试剂一体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后8000g，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。

3.      血清等液体：直接测定。

二、测定操作：

1.      分光光度计预热30 min，调节波长到340 nm，用蒸馏水调零。

2.      试剂三放在25℃（一般物种）或者37℃（哺乳动物）保温。

3.      空白管：取1mL石英比色皿，加入100μL试剂一，900μL试剂二和100μL试剂三，迅速混匀后于340nm测定吸光度变化，记录10 s和310 s吸光度为A1和A2。

4.      测定管：取1mL石英比色皿，加入100μL上清液，900μL试剂二和100μL试剂三，迅速混匀后于340nm测定吸光度变化，记录10 s和310 s吸光度为A3和A4。 注意：空白管只需测定一次。

三、GST活性计算公式：

(1)   按蛋白浓度计算

活性单位定义：在25℃或者37℃中，每毫克蛋白每分钟催化1nmol/L CDNB与GSH结合为1个酶活单位。

GST（nmol/min/mg prot）=[(A4－A3)－(A2-A1)]÷ε÷d×109×V反总÷(Cpr×V样)÷T

=230×[(A4－A3)－(A2-A1)] ÷Cpr

(2)   按样本质量计算

活性单位定义：在25℃或者37℃中，每克样品每分钟催化1nmol/L CDNB与GSH结合为1个酶活单位。

 GST（nmol/min/g）=[(A4－A3)－(A2-A1)]÷ε÷d×109×V反总÷(W×V样÷V样总)÷T =230×[(A4－A3)－(A2-A1)] ÷W

(3)   按细胞数量计算

活性单位定义：在25℃或者37℃中，每104个细胞每分钟催化1nmol/L CDNB与GSH结合为1个酶活单位。

GST（nmol/min/104 cell）=[(A4－A3)－(A2-A1)]÷ε÷d×109×V反总÷(细胞数量×V样÷V样总)÷T =230×[(A4－A3)－(A2-A1)] ÷细胞数量

（4）按液体体积计算

活性单位定义：在25℃或者37℃中，每毫升液体每分钟催化1nmol/L CDNB与GSH结合为1个酶活单位。

     GST（nmol/min/mL）=[(A4－A3)－(A2-A1)]÷ε÷d×109×V反总÷V样÷T

= 230×[(A4－A3)－(A2-A1)]

ε：产物摩尔消光系数，9.6×103 L/mol /cm；d：比色皿光径，1cm；106：1mol=1× 106μmol；V反总：反应体系总体积，1100μL=0.0011 L；Cpr：上清液蛋白质浓度（mg/mL），需要另外测定，建议选用本公司生产的BCA蛋白质浓度测定试剂盒；V样：加入反应体系中上清液体积，100μL=0.1 mL；V样总：加入提取液体积，1mL；W，样本质量，g；T：反应时间（min），5min。

脱氢抗坏血酸还原酶（DHAR）活性测试盒注意事项：

1.      样品处理等过程均需要在冰上进行，且须在当日测定酶活力；

2.      细胞中GST活性测定时，细胞数目须在300万-500万之间，细胞中GST的提取时可加试剂一后研磨或超声波处理，不能用细胞裂解液处理细胞；

3.      本法测定GST活性的线性范围可达76 μmol/min /L，测定前先用1～2个样做预实验，如5min内反应不成线性，须对样品用蒸馏水稀释，计算结果乘以稀释倍数；

4.      测定反映的温度对测定结果有影响，请控制在25℃或者37℃（哺乳动物）。