试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被小鼠半胱氨酸蛋白酶3（Casp-3）捕获抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成*终的黄色。颜色的深浅和样品中的小鼠半胱氨酸蛋白酶3（Casp-3）呈正相关。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度（OD 值），计算样品浓度。

1.  血清：将收集于血清分离管的全血标本在室温放置2小时或4℃过夜，然后1000×g离心20 分钟，取上清即可，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。
2.  血浆：用EDTA或肝素作为抗凝剂采集标本，并将标本在采集后的30分钟内于2-8℃ 1000×g离心15分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。
3. 组织匀浆：用预冷的PBS (0.01M, pH=7.4)冲洗组织，去除残留血液（匀浆中裂解的红细胞会影响测量结果），称重后将组织剪碎。将剪碎的组织与对应体积的PBS（一般按1:9的重量体积比，比如1g的组织样品对应9mL的PBS，具体体积可根据实验需要适当调整，并做好记录。推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂）加入玻璃匀浆器中，于冰上充分研磨。为了进一步裂解组织细胞，可以对匀浆液进行超声破碎，或反复冻融。*后将匀浆液于5000×g离心5~10分钟，取上清检测。

4. 细胞培养物上清或其它生物标本：请1000×g离心20分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

注：标本溶血会影响*后检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测。

 

1.       酶标仪（450nm）

2.       高精度加样器及枪头：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3.       37℃恒温箱

4. 蒸馏水或去离子水

 

备注：

1. 标准品浓度依次为：48、24、12、6、3、1.5 pmol/L

2. 经过大量正常标本检验，标本的正常浓度值均在试剂盒提供的检测范围内，实验过程中直接取50μL样本上样即可。当有部分样本值超过标准品浓度时，可用样本稀释液将标本进行适当稀释后再进行实验。

 

1.        严格按照规定的时间和温度进行温育以保证准确结果。所有试剂都必须在使用前达到室温20-25℃。使用后立即冷藏保存试剂。

2.        洗板不正确可以导致不准确的结果。在加入底物前确保尽量吸干孔内液体。温育过程中不要让微孔干燥掉。

3.        消除板底残留的液体和手指印，否则影响OD值。

4.        底物显色液应呈无色或很浅的颜色，已经变蓝的底物液不能使用。

5.        避免试剂和标本的交叉污染以免造成错误结果。

6.        在储存和温育时避免强光直接照射。

7.        平衡至室温后再打开密封袋以防水滴凝聚在冷板条上。

8.        任何反应试剂不能接触漂白溶剂或漂白溶剂所散发的强烈气体。任何漂白成分都会破坏试剂盒中反应试剂的生物活性。

9.        不能使用过期产品。

10.    如果可能传播疾病，所有的样品都应管理好，按照规定的程序处理样品和检测装置。

 

试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡后方可使用。

20×洗涤缓冲液的稀释：蒸馏水按1：20稀释，即1份20×洗涤缓冲液加19份蒸馏水。

 

1. 从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。

2. 设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；

3. 样本孔中加入待测样本50μL；空白孔不加。

4.  除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

5. 弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350μL），静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。

6. 每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7. 每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

 

以所测标准品的OD值为横坐标，标准品的浓度值为纵坐标，在坐标纸上或用相关软件绘制标准曲线，并得到直线回归方程，将样品的OD值代入方程，计算出样品的浓度。

 

1.  检测范围：1.5 pmol/L – 48 pmol/L。

2.  灵敏度：检测浓度小于0.1 pmol/L。

3.  特异性：不与其它可溶性结构类似物交叉反应。