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微量法
注意:正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
测定意义
漆酶(Laccase)是一种含铜的多酚氧化酶,属于铜蓝氧化酶家族,广泛分布于真菌和高等植物中,具有较强的氧化还原能力,在纸浆生物漂白,环境污染物降解和木质纤维素降解以
及生物检测方面有非常广泛的应用。
测定原理
漆酶分解底物ABTS产生ABTS自由基,在420nm处的吸光系数远大于底物ABTS,测定ABTS 自由基的增加速率,可计算得漆酶活性。
自备实验用品及仪器
天平、低温离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96 孔板、震荡仪。
试剂组成和配制
提取液:液体 100mL×1 瓶,4℃保存。
试剂一:液体 20mL×1 瓶,4℃保存。
工作液:粉剂×2 瓶,4℃避光保存,临用前每瓶加 10mL 试剂一溶解。
样本处理
将新鲜土样过40目筛,按照土样质量(g):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取0.1g土样,加入1mL提取液)加入提取液,30℃震荡提取30min,于 4℃,10000g,离心10min,取上清置于冰上待测。
测定操作
1. 可见分光光度计/酶标仪预热30min,调节波长到420nm,蒸馏水调零。
2. 取微量石英比色皿/96孔板,加入30μL上清液,再加入170μL工作液,混匀立即于420nm
处测定吸光值,记为 A1。
3. 记录完数据立即 30℃震荡反应 5min 后于420nm 处测定吸光值,记为 A2。△ A=A2-A1