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可见分光光度法
注意:正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
测定意义:
锌是必需的微量元素,在胰岛素和卟啉代谢中也起重要作用。
测定原理:
在pH 8.5~9.5的溶液中,Zn2+与锌试剂生成蓝色配位化合物,在620nm有吸收峰。
自备仪器和用品:
可见分光光度计、离心机、可调式移液枪、1mL玻璃比色皿、蒸馏水和无水乙醇。
试剂组成和配制:
试剂一:液体×1 瓶,4℃保存。
试剂二:液体×1 瓶,4℃保存。
试剂三:液体×1 瓶,4℃保存。
试剂四:粉剂×1 瓶,4℃保存。临用前1天配制,加入25 mL无水乙醇充分溶解,盖紧,过夜待用。4℃保存可稳定约1个月,如颜色变黄,则已失效。
标准液:液体×1 支,10μmol/L Zn2+标准液。4℃保存。
测定操作:
1. 分光光度计预热30min,调节波长到620nm,蒸馏水调零。
2. 标准液解冻:提前取出标准液,置于室温下充分解冻后混匀。
3. 空白管:取EP管,依次加入500μL蒸馏水,1000μL试剂一,混匀;室温,8000g,离心10min,小心吸取上清液500μL,加入1mL玻璃比色皿,加入500μL试剂二,500μL试剂三,充分混匀后25℃静置 10min,于620nm测定吸光度,记为A空白管。
4. 标准管:取EP管,依次加入500μL标准液,1000μL试剂一,混匀;室温,8000g,离心10min,小心吸取上清液500μL,加入1mL玻璃比色皿,加入500μL试剂二,500μL试剂三,充分混匀后 25℃静置10min,于620nm 测定吸光度,记为A标准管。
5. 测定管:取EP管,依次加入500μL 血清,1000μL试剂一,混匀;室温,8000g,离心10min,小心吸取上清液500μL,加入1mL玻璃比色皿,加入500μL试剂二,500μL试剂三,充分混匀后 25℃静置10min,于620 nm 测定吸光度,记为A测定管。
注意:空白管和标准管只需测定一次。