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可见分光光度法
注意:正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
测定意义
果胶酶(pectinase)是一类分解果胶质酶类的总称,包括原果胶酶,果胶酯酶,多聚半乳糖醛酸酶和果胶裂解酶四大类,广泛存在于植物果实和微生物中,主要用于食品、酿酒、环保、医药、纺织及日化用品行业。
测定原理
果胶酶水解果胶生成半乳糖醛酸,具有还原性醛基,与 DNS 试剂反应生成红棕色物质,在540nm有特征吸收峰,测定540nm处吸光值变化可计算得果胶酶活性。
自备实验用品及仪器
天平、低温离心机、可见分光光度计、1 mL 玻璃比色皿、恒温水浴锅。
试剂组成和配制
提取液:液体 50mL×1 瓶,4℃保存。
试剂一:液体 20mL×1 瓶,4℃保存。
试剂二:液体 25mL×1 瓶,4℃避光保存。
酶液提取
1.组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g 组织,
加入1mL提取液),进行冰浴匀浆。10000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。
2.细菌、真菌:按照细胞数量(104个):提取液体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500万细胞加入1mL提取液),冰浴超声波破碎细胞(功率300w,超声3秒,间隔7秒,总时间3min);然后 10000g,4℃离心 10min,取上清置于冰上待测。
3. 细胞培养液等:直接检测。
测定操作表
| 对照管 | 测定管 |
试剂一(µL) | 0.4 | 0.4 |
50℃水浴温育 5min | ||
样本(µL) |
| 0.1 |
煮沸样本(µL) | 0.1 |
|
混匀,50℃水浴反应 30min | ||
试剂二(µL) | 0.5 | 0.5 |
沸水浴 5min,冰浴冷却终止反应,8000rpm,4℃,离心 10min,取上清,蒸馏水调零,1mL 玻璃比色皿测定 540nm 处吸光值 A,△A=A 测定管-A对照管。 |