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可见分光光度法
注意:正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
测定意义
糖化酶,即葡萄糖淀粉酶(EC3.2.1.3),又称 γ-淀粉酶,是一种外切型糖苷酶,它从淀粉的非还原性末端水解 α-1,4 糖苷键和 α-1,6 糖苷键,将淀粉完全水解为葡萄糖,因此广泛的应用于酒精、白酒、抗生素、氨基酸、有机酸,甘油,淀粉糖等工业中,是我国重要的工业酶制剂。
测定原理
糖化酶水解可溶性淀粉生成葡萄糖,与 3,5-二硝基水杨酸生成红棕色化合物,在 540nm 处有光吸收,在一定范围内反应液颜色深浅与葡萄糖的量成正比,可测定计算得糖化酶的
活力。
自备实验用品及仪器
天平、低温离心机、可见分光光度计、1 mL玻璃比色皿、恒温水浴锅。
试剂组成和配制
提取液:液体 50mL×1 瓶,4℃保存。
试剂一:液体 25mL×1 瓶,4℃保存。
试剂二:液体 25mL×1 瓶,4℃避光保存。
酶液提取
1. 组织:按照质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g,加入1mL提取液)加入提取液,冰浴匀浆后于 4℃,10000g 离心 10min,取上清置于冰上待测。
2. 细胞:按照细胞数量(104个):提取液体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500万细胞加入1mL提取液),冰浴超声波破碎细胞(功率300w,超声3秒,间隔7秒,总时间3min);然后 4℃,10000g 离心10min,取上清置于冰上待测。
3. 培养液或其它液体:直接检测。
测定操作
| 对照管 | 测定管 |
样本(μL) |
| 50 |
灭活样本(μL) | 50 |
|
试剂一(μL) | 500 | 500 |
充分混匀,40℃反应 20min | ||
试剂二(μL) | 450 | 450 |
混匀,沸水浴5min,自来水冷却后,于1mL玻璃比色皿,蒸馏水调零,测定540nm处吸光值 A,△A=A测定管-A对照管 |