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微量法
正式测定前请选择2-3个预期差异较大的样本做预测定
测定意义:
糖类物质是构成植物体的重要组成成分,也是新陈代谢的主要原料和贮存物质。总糖也可称为碳水化合物,包括可溶性的单糖,二糖以及不溶性的淀粉,纤维素,几丁质等。
测定原理:
总糖酸水解为还原糖,在 NaOH 和丙三醇存在下,DNS 试剂与还原糖共热后被还原成氨基
化合物,在过量的 NaOH 碱性溶液中呈桔红色,在 540nm 处有吸收峰,以此测定样品中的总糖含量。
需自备的仪器和用品:
可见分光光度计/酶标仪、沸水浴、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研钵、蒸馏水。
试剂的组成和配制:
试剂一:液体 100mL×1 瓶,4℃保存;
试剂二:液体 100mL×1 瓶 ,4℃保存;
试剂三:液体 5mL×1 瓶 ,4℃避光保存
标准品:粉剂×10mg支,4℃保存;临用前加入 1mL 蒸馏水溶解,制备 10mg/mL 葡萄糖标准液。
样品中总糖的提取:
称取约 0.1g 样品,加入 1mL 试剂一,1.5mL 蒸馏水,匀浆,95℃水浴中加热 30min,加入1mL 试剂二,混匀,用蒸馏水定容至 10mL,8000g 25℃离心 10min,取上清液待测。(注意稀释,见注意事项)
测定步骤:
1、分光光度计或酶标仪预热30min以上,调节波长至540nm,蒸馏水调零。
2、调节水浴锅至95度。
3、加样表 :
试剂(μL) | 标准管 | 测定管 |
样本 |
| 8 |
标准品 | 8 |
|
蒸馏水 | 8 | 8 |
试剂三 | 12 | 12 |
混匀,置 95 度水浴中 10min(盖紧,以防止水分散失),冷却至室温 | ||
蒸馏水 | 172 | 172 |
注意:如果ΔA大于3,需要将上清液用蒸馏水稀释,计算公式中乘以相应稀释倍数。