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可见分光光度法
正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
测定意义:
蔗糖酶(EC 3.2.1.26)是碳水化合物消化吸收的关键酶,能够水解蔗糖变成相应的单糖而被机体吸收。
测定原理:
本试剂盒采用3.5-二硝基水杨酸法测定蔗糖酶催化产生的还原糖的含量,由此可得出蔗糖酶水解速度。其原理是3.5-二硝基水杨酸与还原糖共热被还原成棕红色的氨基化合物,在
一定范围内还原糖的量和反应液的颜色深度成正比。此法操作简便、迅速、杂质干扰较小。
所需的仪器和用品:
可见分光光度计、沸水浴、可调式移液器、1mL 玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。
试剂的组成和配制:
提取液:液体60mL×1 瓶,4℃保存;
试剂一:液体2.5mL×1 瓶,4℃保存;
试剂二:粉剂×1支,4℃保存,用时加入1.5mL 蒸馏水充分溶解;用不完的试剂4℃可保存一周;
试剂三:液体 5mL×1 瓶,常温保存;
样品测定的准备:
按照组织质量(g):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入 1mL提取液),进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
加样表和测定步骤:
试剂名称(μL) | 对照管 | 测定管 |
试剂一 | 50 | 50 |
蒸馏水 | 50 |
|
样本 | 100 | 100 |
试剂二 |
| 50 |
置于 25℃准确水浴 10min | ||
试剂三 | 100 | 100 |
混匀,95℃水浴 5min 左右(盖紧,防止水分散失),冷却至室温 | ||
蒸馏水 | 700 | 700 |
混匀,520nm蒸馏水调零,测定各管吸光值,ΔA=A测定-A对照,每个测定管设一个对照管。