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微量法
正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
测定意义
蔗糖是源(叶片等)光合产物向“库”器官运输的主要形态。SS(EC 2.4.1.13)催化植物体内游离果糖和葡萄糖合成蔗糖。
测定原理
SS催化游离果糖与葡萄糖供体UDPG反应生成蔗糖,蔗糖与间苯二酚反应可呈现颜色变化,在480nm下有特征吸收峰,酶活力大小与颜色的深浅成正比。
需自备的仪器和用品
可见分光光度计/酶标仪、水浴锅、离心机、移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰
试剂的组成和配制
提取液:液体 100mL×1 瓶,4℃保存;
试剂一:液体 2.5mL×1 瓶,-20℃保存;
试剂二:1000μg/mL 蔗糖溶液 10mL×1 瓶,4℃保存;
试剂三:液体 2mL×1 瓶,4℃保存
试剂四:液体 25mL×1 瓶,4℃保存;
试剂五:液体 6mL×1 瓶,4℃保存;
样品测定的准备:
按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入 1mL提取液),进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
测定步骤
1、分光光度计或酶标仪预热30min以上,调节波长至480nm,蒸馏水调零。
2、样本测定,(在EP管中依次加入下列试剂):
试剂名称(μL) | 测定管 | 对照管 | 标准管 | 空白管 |
样本 | 10 | 10 |
|
|
蒸馏水 |
| 45 | 45 | 55 |
试剂二 |
|
| 10 |
|
试剂一 | 45 |
|
|
|
混匀,25℃准确水浴 10min | ||||
试剂三 | 15 | 15 | 15 | 15 |
沸水浴中煮沸 10min 左右(盖紧,以防止水分散失),冷却 | ||||
试剂四 | 210 | 210 | 210 | 210 |
试剂五 | 60 | 60 | 60 | 60 |
混匀,沸水浴30min,冷却后,取200μL至微量石英比色皿或96孔板中,480nm下测定各管吸光值。标准管和空白管只要做一管。每个测定管需要设一个对照管。