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可见分光光度法
正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
测定意义:
蔗糖转化酶(Invertase,Ivr)催化蔗糖不可逆地分解为果糖和葡萄糖,是高等植物蔗糖代谢关键酶。根据*适 pH,Ivr 分为酸性转化酶(AI)和中性转化酶(NI)两种类型。
AI 的*适 pH 为 3~5。AI 分为可溶性 AI(S-AI)和细胞壁不溶性 AI(B-AI)两种类型。S-AI 主要存在于细胞液泡或自由空间中,*适 pH 为 4.5~5.0(酸性),通过降解液泡中蔗糖,调节液泡中蔗糖的利用和果实内糖类的积累。
测定原理:
S-AI 催化蔗糖降解产生还原糖,进一步与 3,5-二硝基水杨酸反应,生成棕红色氨基化合物,在 510nm有特征光吸收,在一定范围内 510nm 光吸收增加速率与 S-AI 活性成正比。
自备用品:
可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、移液器、1mL 玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。
试剂组成和配制:
提取液:液体 50mL×1 瓶,4℃保存;
试剂一:液体 50mL×1 瓶,4℃保存;
试剂二:粉剂×1 瓶,4℃保存;临用前加入25mL试剂一充分溶解备用;用不完的试剂 4℃
保存;
试剂三:液体 30mL×1 瓶,4℃保存;
粗酶液提取:
按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL提取液),进行冰浴匀浆。12000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
测定步骤和加样表:
试剂名称(μL) | 测定管 | 对照管 |
样本 | 200 | 200 |
试剂一 |
| 800 |
试剂二 | 800 |
|
混匀, 37℃准确水浴 30min 后,95℃水浴 10min(盖紧,以防水分散失),流水冷却后充分 混匀(以保证浓度不变) | ||
试剂三 | 500 | 500 |
混匀,95℃水浴 10min(盖紧,以防止水分散失),流水冷却后充分混匀,510nm 处,蒸馏水调零,记录各管吸光值 A,如果吸光值大于 2,可以用蒸馏水稀释后测定(计算公式中乘以相应稀释倍数),ΔA=A 测定-A 对照。