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微量法
注意:正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
测定意义:
SP(EC2.4.1.7)主要存在于微生物和植物中,裂解葡萄糖苷键,催化葡萄糖基转移到果糖、木糖、半乳糖和鼠李糖等,合成相应的葡萄糖基低聚糖。此外,SP还能催化氢醌合成熊果苷,
具有极强的美白效果,在化妆品工业中具有重要应用。
测定原理:
SP能够以磷酸为受体,催化蔗糖产生1-磷酸葡萄糖,在葡萄糖磷酸变位酶催化下变位为6-磷酸葡萄糖,在6-磷酸葡萄糖脱氢酶作用下还原NADP+生成NADPH,导致340nm光吸收值增加。测定340nm吸光度增加速率,即可计算SP活性。
自备实验用品及仪器:
天平、低温离心机、恒温水浴锅、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板和蒸馏水。
试剂组成和配制:
提取液:液体 100mL×1 瓶,4℃保存。
缓冲液:液体 10mL×1 瓶,4℃保存。
试剂一:液体 5mL×1 瓶,4℃保存。
试剂二:液体 1.5mL×1 支,4℃保存。
试剂三:液体 1mL×1 支,4℃保存。
试剂四:粉剂 1 支,-20℃避光保存,临用前加1mL双蒸水溶解。
试剂五:粉剂 1 支,-20℃避光保存,临用前加1mL双蒸水溶解。
试剂六:粉剂 1 支,-20℃避光保存,临用前加2mL双蒸水溶解。
试剂七:粉剂 1 支,-20℃避光保存,临用前加2mL双蒸水溶解。
粗酶液提取:
1. 组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL提取液)进行冰浴匀浆,然后10000g,4℃,离心10min,取上清待测。
2. 细菌、真菌:按照细胞数量(104个):提取液体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500万细胞加入1mL提取液),冰浴超声波破碎细胞(功率300w,超声3秒,间隔7秒,总时间3min);然后 10000g,4℃,离心10min,取上清置于冰上待测。
测定操作表:
1、分光光度计/酶标仪预热30min,调节波长至340nm。
2、操作表
| 对照管 | 测定管 |
缓冲液(μL) | 85 | 65 |
试剂一(μL) | 50 | 50 |
试剂二(μL) | 3 | 3 |
试剂三(μL) | 2 | 2 |
试剂四(μL) | 10 | 10 |
试剂五(μL) | 10 | 10 |
试剂六(μL) | 20 | 20 |
试剂七(μL) | 20 | 20 |
混匀,37℃水浴预热 5min | ||
样本(μL) |
| 20 |
迅速混匀,于微量石英比色皿/96孔板,对照管调零,测定340nm的初始值A1,测定完立即放入 37℃水浴准确反应2min,对照管调零,迅速测定340nm吸光值A2,△A=A2-A1。 |
SP 活性计算公式: