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活性测定试剂盒说明书
紫外分光光度法
正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
测定意义
AGP (EC 2.7.7.21)主要存在于植物中,催化葡萄糖-1-磷酸与ATP反应生成淀粉合成的直接前体 ADPG,是植物淀粉生物合成的主要限速步骤。
测定原理
AGP催化的逆向反应生成G1P,在反应体系中添加的磷酸己糖变位酶和6-磷酸葡萄糖脱氢酶依次催化生成6-磷酸葡萄糖酸和NADPH,340nm下测定NADPH增加速率,即可计算AGP活性。
需自备的的仪器和用品
紫外分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1 mL 石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水
试剂的组成和配制
提取液:液体 30mL×1 瓶,4℃保存;
试剂一:液体 10mL×1 瓶,4℃保存;
试剂二:粉剂×1 支,4℃保存;临用前加入250μL蒸馏水充分溶解备用;用不完的试剂仍 4℃保存;
试剂三:粉剂×1 瓶,4℃保存;临用前加入2mL蒸馏水充分溶解备用;用不完的试剂仍4℃
保存;
试剂四:粉剂×1 瓶,4℃保存;临用前加入3mL蒸馏水充分溶解备用;用不完的试剂仍4℃保存;
试剂五:粉剂×1 瓶,-20℃保存;临用前加入3mL蒸馏水充分溶解备用;用不完的试剂仍-20℃保存;
试剂六:粉剂×1 支,-20℃保存;临用前加入250μL蒸馏水充分溶解备用;用不完的试剂 4℃保存;
试剂七:粉剂×1 支,-20℃保存;临用前加入250μL蒸馏水充分溶解备用;用不完的试剂 4℃保存;
粗酶液制备
按照组织质量(g):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入 1mL提取液),进行冰浴匀浆。10000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
测定步骤 :
1、分光光度计预热30min以上,调节波长至340nm,蒸馏水调零。
2、试剂一置30℃保温10min以上。
3、在EP管中按顺序加入下列试剂(如果一次性测定样本较多,可以将试剂一、二、三和四按比例配成混合液 1,将试剂一、五、六和七按比例配成混合液 2)
试剂名称(μL) | 测定管 |
试剂一 | 100 |
试剂二 | 10 |
试剂三 | 50 |
试剂四 | 100 |
样本 | 20 |
混匀,30℃保温 15 min,置沸水浴中 1 min(盖紧,防止水分散失),冰浴迅速冷却 | |
试剂一 | 300 |
试剂五 | 100 |
试剂六 | 10 |
试剂七 | 10 |
混匀后立即在 340 nm 波长下记录初始吸光度 A1 和 2min 后的吸光度 A2,计算 ΔA=A2-A1。