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可见分光光度法
注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
测定意义：
AKP是指在碱性条件下催化蛋白质肽键水解的酶类，属于丝氨酸蛋白酶。此外，该酶还能够水解酯键、酰胺键，具有转酯及转肽的功能。该酶是主要工业用酶，广泛应用于制药、丝绸、食品、制革等行业。
测定原理：
在碱性条件下，AKP 水解酪蛋白生成酪氨酸；在碱性条件下，酪氨酸还原磷钼酸生成钨蓝；钨蓝在680nm有特征吸收峰，测定680nm吸光度增加速率，来计算AKP活性。
自备仪器和用品：
可见分光光度计、水浴锅、磁力搅拌器、可调式移液枪、1.5 mL EP管、1mL玻璃比色皿和蒸馏水。
试剂组成和配制：
试剂一：液体×1 瓶，4℃保存。
试剂二：粉剂×1 瓶，4℃保存。临用前加10mL蒸馏水溶解。
试剂三：粉剂×1 瓶，4℃避光保存。临用前加入10mL试剂一，沸水浴中溶解。
试剂四：粉剂×1 瓶， 4℃保存。临用前加50mL蒸馏水溶解。
试剂五：液体×1 瓶，4℃保存。
标准品：液体×1 支，0.25 μmol/mL标准酪氨酸溶液，4℃保存。
粗酶液提取：
1. 组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，
加入1mL试剂一）冰浴匀浆，8000g，4℃离心 10min，取上清，即粗酶液。
2. 血清或培养液：直接测定。
3. 细菌、真菌：按照细胞数量（104个）：试剂一体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后 8000g，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。
测定操作：
1. 分光光度计预热30min，调节波长到680nm，蒸馏水调零。
2. 试剂二、试剂三和试剂四置于40℃水浴保温30min。
3. 对照管：取一支EP管，加入100μL粗酶液（血清或培养液），200μL试剂二，混匀后置
于40℃水浴保温10min；加入200μL试剂三，混匀后8000g ，4℃离心10min；取200μL上清液，加入新的EP管，再加入1000μL试剂四，200μL试剂五，混匀后置于40℃水浴保温20min，于680nm测定光吸收，记为A对照管。
4. 测定管：取一支 EP管，加入100μL粗酶液（血清或培养液），200μL试剂三，混匀后置于40℃水浴保温10min；加入200μL试剂二，混匀后8000g ，4℃离心10min；取200μL上清液，加入新的 EP管，再加入1000μL试剂四，200μL试剂五，混匀后置于 40℃水浴保温20min，于680nm测定光吸收，记为A测定管。（注意与对照管不同，先加试剂三，后加试剂二）（注意与对照管不同，先加试剂三，后加试剂二）
5. 空白管：取一支EP 管，加入200μL 蒸馏水，1000μL试剂四 200μL试剂五，混匀后置于40℃水浴保温20min，于680nm测定光吸收，记为A空白管。
6．标准管：取 EP管，加入 200μL标准品，1000μL试剂四，200μL试剂五，混匀后置于40℃水浴保温 20min，于680nm 测定光吸收，记为A标准管。
注意：空白管和标准管只需要测定一次。
