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紫外分光光度法
正式测定前务必取 2-3个预期差异较大的样本做预测定
测定意义:
GOGAT分布于植物中,和谷氨酰胺合成酶共同构成 GS/GOGAT 循环,参与氨同化的调控。
测定原理:
GOGAT催化谷氨酰胺的氨基转移到α-酮戊二酸,形成两分子的谷氨酸;同时NADH氧化生成 NAD+,340nm吸光度的下降速率可以反映GOGAT活性大小。
需自备的仪器和用品:
紫外分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL 石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水。
试剂组成和配制:
提取液:液体 60mL×1 瓶,4℃保存;
试剂一:液体 60mL×1 瓶,4℃保存;
试剂二:粉剂×1 支,4℃保存;
试剂三:粉剂×1 支,4℃保存;
试剂四:粉剂×1 支,-20℃保存。
粗酶液提取:
细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104个):提取液体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500万细菌或细胞加入1mL提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率20%或200W,超声3s,间隔10s,重复30次);8000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL提取液),进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。
测定步骤:
1、 分光光度计预热30min以上,调节波长至340nm,蒸馏水调零。
2、 样本测定
(1)工作液的配制:临用前将试剂二、三、四转移到试剂一中混合溶解,置于 37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)水浴5min;现配现用;
(2)取0.1mL样本和1mL工作液于1mL比色皿中,混匀,加工作液的同时开始计时,在340nm波长下记录20秒时的初始吸光度A1和5分20秒时的吸光度A2,计算ΔA=A1-A2。