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微量法
注意:正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
测定意义:
γ-GT是γ-谷氨酰循环中的关键酶,催化GSH降解。γ-GT催化GSH或者其他γ-谷氨酰基化合物上的γ-谷氨酰基转移到受体。也可以催化GSH和其他γ-谷氨酰基化合物的水解,产生谷氨酸盐,在细胞外谷胱甘肽新陈代谢中起了重要的作用。
测定原理:
γ-GT催化谷氨酰对硝基苯胺中γ-谷氨酰基转移给N-甘氨酰甘氨酸,生成对硝基苯胺,在405nm有特征光吸收;通过测定405nm光吸收增加速率,来计算γ-GT酶活性。
自备仪器和用品:
低温离心机、水浴锅、可调节移液器、可见分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96 孔板、和蒸馏水
试剂组成和配制:
试剂一:液体×1 瓶,4℃保存。
试剂二:粉剂×1 瓶,4℃保存。
试剂三:液体×1 瓶,4℃保存。
试剂四:液体×1 瓶,4℃保存。
工作液(在试剂二瓶中配制):临用前配制,把试剂三倒入试剂二瓶中,充分溶解(室温过低时可以40℃水浴促进溶解);然后把试剂四倒入试剂二瓶中,混匀后室温保存。
粗酶液提取:
1. 组织:按照组织质量(g):试剂一体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL试剂一)进行冰浴匀浆。8000g,4℃离心 15min,取上清,置冰上待测。
2. 细菌、真菌:按照细胞数量(104个):试剂一体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500万细胞加入1mL试剂一),冰浴超声波破碎细胞(功率300w,超声3秒,间隔7秒,总时间3min);然后8000g,4℃,离心15min,取上清置于冰上待测。
3. 血清等液体:直接测定。
γ-GT 测定操作:
1. 分光光度计/酶标仪预热30min,调节波长到405nm,蒸馏水调零。
2. 试剂二置于25℃(一般物种)或者37℃(哺乳动物)水浴中预热30min(保证无沉淀)。
3. 测定管:取微量玻璃比色皿或96孔板,依次加入20μL上清液,180μL工作液,混匀后于 405nm 测定10s和70s时吸光度,记为A1和A2。