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紫外分光光度法
正式测定前务必取 2-3个预期差异较大的样本做预测定
测定意义:
XOD(EC 1.17.3.2)催化黄嘌呤氧化生成尿酸和超氧阴离子,是活性氧主要来源;同时也是核苷酸代谢的关键酶。XOD主要分布于哺乳动物的心,肺,肝脏等组织中,当肝功能受损时,XOD大量释放到血清中,对肝损害的诊断具有特异性的意义。
测定原理:
XOD催化黄嘌呤产生尿酸,尿酸在290nm下有特征吸收峰。
需自备的仪器和用品:
紫外分光光度计、台式离心机、可调式移液器、1mL石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水。
试剂组成和配制:
提取液:60mL×1 瓶,4℃保存;
试剂一:60mL×1 瓶,4℃保存;
试剂二:粉剂×4 瓶,4℃保存。
粗酶液提取:
1、细菌、细胞或组织样品的制备:
细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104个):提取液体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议500万细菌或细胞加入1mL提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率20%或200W,超声3s,间隔10s,重复30次);8000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入1mL提取液),进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
2、血清(浆)样品:直接检测。
操作步骤:
1、分光光度计预热 30min 以上,调节波长至 290nm,蒸馏水调零。
2、XOD 检测工作液的配制:用时在每瓶试剂二中加入 15mL 试剂一,充分混匀,待用;用
不完的试剂 4℃可保存一周;
3、测定前将 XOD 检测工作液 37℃(哺乳动物)或 25℃(其它物种)水浴 10min。
4、取 1mLXOD 检测工作液于 1mL 石英比色皿中,再加入 35μL 样本,混匀,室温下立即
测定 290nm下的初始吸光值 A1 和 1min 后的吸光值 A2,计算 ΔA=A2-A1。