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微量法
正式测定前取2-3个预期差异较大的样本做预测定
测定意义
GOD(EC 1.1.3.4)广泛存在于动物、和植物中,催化葡萄糖氧化生成葡萄糖酸,并产生H2O2 ,是生物体中产生活性氧的代谢途径。
测定原理
GOD催化产生H2O2,过氧化物酶在有氧存在时催化H2O2分解产生的氧又将邻联茴香胺氧化生成有色物质,颜色深浅与葡萄糖氧化酶活性成线性关系。
试验中所需的仪器和设备
可见分光光度计/酶标仪、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研钵、冰、蒸馏水
试剂的组成和配制
提取液:液体 100mL×1 瓶,4℃保存;
试剂一:液体 19.2mL×1 瓶,4℃保存;
试剂二:液体 4mL×1 瓶,4℃保存;
试剂三:液体 1mL×1 支,4℃保存;
样品测定的准备
组织处理:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL提取液),进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。
血清(浆):直接检测。
测定步骤
1、分光光度计或酶标仪预热30min以上,调节波长至500nm,蒸馏水调零。
2、GOD 检测工作液的配制:用时将试剂二和试剂三转移至试剂一中,充分混匀,待用;用不完的试剂4℃可保存一周;
3、测定前将GOD检测工作液在37℃(哺乳动物)或 25℃(其它物种)水浴10min以上。
4、在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL样本和240μL工作液,立即混匀并计时,记录500nm下20s吸光值A1和1min20s后的吸光值A2。计算ΔA=A2-A1。