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紫外分光光度法
测定意义:
CAT(EC 1.11.1.6)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,是*主要的H2O2清除酶,在活性氧清除系统中具有重要作用。
测定原理:
H2O2在240nm下有特征吸收峰,CAT能够分解H2O2,使反应溶液240nm下的吸光度随反应时间而下降,根据吸光度的变化率可计算出CAT活性。
需自备的仪器和用品:
紫外分光光度计、台式离心机、可调式移液器、1mL石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水
试剂组成和配制:
提取液:60mL×1瓶,4℃保存;
试剂一:60mL×1瓶,4℃保存;
试剂二:100uL×3瓶,4℃保存。
粗酶液提取:
1、细菌、细胞或组织样品的制备:
细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104个):提取液体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500万细菌或细胞加入1mL提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率20%或200W,超声3s,间隔10s,重复30次);8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。
组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL提取液),进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。
2、血清(浆)样品:直接检测。
测定步骤:
1、分光光度计预热30min以上,调节波长至240nm处,蒸馏水调零。
2、CAT检测工作液的配制:用时在每瓶试剂二(100 uL)中加入20mL试剂一,充分混匀,作为工作液;用不完的试剂4℃保存一周;
3、测定前将CAT检测工作液37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)水浴10min。
4、取1mLCAT检测工作液于1mL石英比色皿中,再加入35μL样本,混匀;室温下立即测定240nm下的初始吸光值A1和1min后的吸光值A2,计算ΔA=A1-A2