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可见分光光度法
注意:正式测定之前选择 2-3个预期差异大的样本做预测定。
测定意义
维生素 E(Vitamin E)是一种脂溶性维生素,其水解产物为生育酚,是生物体中*主要的抗氧化剂,能阻止不饱和脂肪酸收到过氧化作用的损伤,维持不饱和脂肪酸细胞膜的完整性和正常功能,具有延缓衰老、预防溶血性贫血作用,在医药、化妆品、保健品、食品行业
具有较高的应用价值。
测定原理
VE还原Fe3+为Fe2+ ,Fe2+与1,10-菲罗啉产生有色络合物,在530nm有特征吸收峰。
自备实验用品及仪器
天平、研钵、离心机、可见分光光度计、1mL玻璃比色皿、漩涡震荡仪。
试剂组成和配制
提取液:液体 100mL×1 瓶,4℃保存。
试剂一:液体 5mL×1 瓶,4℃避光保存。
试剂二:液体 5mL×1 瓶,4℃保存。
试剂三:液体 5mL×1 瓶,4℃保存。
试剂四:液体 15mL×1 瓶,4℃保存。
样本处理
1. 组织:按照质量(g):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约0.2g,加入1mL提取液)加入提取液,充分匀浆后用提取液定至 2mL,在漩涡混匀仪上震荡 5min,于25℃,5000g 离心 10min,取上层测定。
2. 细胞:按照细胞数量(104个):提取液体积(mL)为500~1000:1 的比例(建议1000万细胞加入2mL提取液),冰浴超声波破碎细胞(功率300w,超声3秒,间隔7秒,总时间3min);在漩涡混匀仪上震荡 5min,于25℃,5000g 离心10min,取上层测定。
3. 血清:取0.2mL,加1.9mL提取液,漩涡仪混匀上震荡5min,于25℃,5000g 离心10min,取上层测定。
测定操作
| 对照管 | 测定管 |
样品(μL) | 500 | 500 |
试剂一(μL) | 100 | 100 |
试剂二(μL) |
| 100 |
试剂三(μL) | 100 |
|
充分混匀,25℃反应 5min | ||
试剂四(μL) | 300 | 300 |
充分混匀,于1mL玻璃比色皿,无水乙醇调零,测定530nm处吸光值,记为 A对照管和A测定管,△A=A测定管-A对照管。 |