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可见分光光度法
注意:正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
测定意义
植酸酶(phytase)是催化植酸及其盐类水解为肌醇与磷酸(盐)的一类酶的总称,属磷酸单酯水解酶,它能将食品和饲料中植酸及其盐转化为可供有机体利用的有效磷,降低粪便中的磷含量,减轻对环境的污染,改善营养成分的吸收和利用,因此具有极其广泛的研究和应用价值。
测定原理
植酸酶在一定温度和pH值条件下,水解底物植酸钠生成无机磷与肌醇衍生物,无机磷在酸性环境中与钼酸铵显色剂反应生成蓝色复合物,在700nm处有特征吸收峰,根据700nm处吸光值变化可计算得植酸酶活性。
自备实验用品及仪器
天平、低温离心机、可见分光光度计、1 mL 玻璃比色皿、恒温水浴锅,超声溶解器,回旋式振荡器。
试剂组成和配制
提取液:液体 50mL×1 瓶,4℃保存。
缓冲液:液体 25mL×1 瓶,4℃保存。
试剂一:粉剂×2 瓶,4℃保存, 临用前加缓冲液10mL配制,现用现配。
试剂二:液体 25mL×1 瓶,4℃保存。
试剂三:液体 24mL×1 瓶,4℃保存。
显色剂:粉剂×6 瓶,4℃保存,临用前根据用量每瓶加1mL双蒸水溶解,再加4mL试剂三混匀
样本处理
1. 酶制剂:按照质量(g):提取液体积(mL)为1:500~1000的比例(建议称取约 0.001g,加入1mL提取液)加入提取液,在超声波溶解器上溶解15min,再用回旋式振荡器振荡15min,待测。
2. 组织:按照质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g,加入1mL提取液)加入提取液,在超声波溶解器上溶解15min,再用回旋式振荡器振荡15min,4℃,4000g 离心10min,取上清待测。
3. 饲料样品:饲料烘干粉碎,过40目筛,按照质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g,加入1mL提取液)加入提取液,在超声波溶解器上溶解 15min,再用回旋式振荡器振荡15min,4℃,4000g 离心10min,取上清待测。
4. 培养液等液体样品,混匀直接测定。
测定操作表
| 对照管 | 测定管 |
样本(µL) | 100 | 100 |
37℃温育 5min | ||
试剂一(µL) |
| 400 |
试剂二(µL) | 500 |
|
37℃温育 30min | ||
试剂一(µL) | 400 |
|
试剂二(µL) |
| 500 |
显色剂(µL) | 500 | 500 |
室温静置10min,4000rpm,4℃,离心10min,取上清1mL,缓冲液调零测定700nm 处吸光值,△A=A 测定管-A 对照管 |