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微量法
注意:正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
测定意义:
土壤脱氢酶(Soil dehydrogenase, sDHA)的活性可以反映土壤体系内活性微生物量以及其对有机物的降解活性,可以作为土壤微生物的降解性能指标。
测定原理:
氢受体 2, 3, 5 - 氯化三苯基四氮唑(2,3,5-Triphenyl Tetrazolium Chloride, TTC)在细胞呼吸过程中接受氢以后,被还原为三苯基甲鐟(Triphenyl Formazone, TF),TF 呈现红色,在波长485nm处有吸收峰,采用分光光度法于485nm测定其吸光值,即得土壤脱氢酶活性。
自备实验仪器及用品:
筛子、天平、恒温培养箱或水浴锅、低温离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96 孔板、冰、蒸馏水、丙酮(不允许快递,请用户自备)。
试剂的组成和配制:
试剂一:粉剂×1 瓶,使用前加 5mL 水溶解,4℃避光保存(尽量现配现用)。
试剂二:液体 20mL×1 瓶,4℃保存。
试剂三:丙酮,自备。
样品处理:
1. 土壤样品: 准确称取过40目筛的新鲜土壤样品约0.1g(以保证TTC与土壤颗粒充分接触)。
2. 污泥样品:污泥用蒸馏水洗涤,10000g,25℃,离心10min,弃上清,反复3-4次。
测定步骤和操作表:
1、分光光度计/酶标仪预热 0min,调节波长至485nm。
2、操作表
| 对照管 | 测定管 |
样品(g) | 0.05 | 0.05 |
试剂一(mL) |
| 0.1 |
试剂二(mL) | 0.2 | 0.1 |
置于 EP 管中,充分混匀,37℃,暗培养 6h,取出后立即冰浴 5min | ||
试剂三(mL) | 0.1 | 0.1 |
反复震荡数次,37℃保温 10min,10000g,4℃,离心 5min,取 200μL 上清于微量石英比色 皿/96 孔板,对照管调零,测定 A 485 。 |