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微量法
正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
测定意义:
GCS( EC 2.4.1.11 )催化UDPG和葡萄糖残基生成糖原和UTP,以α-1,4-糖苷键相连延长糖链,是肝和肌肉糖原合成酶的限速酶,是胰岛素作用的主要靶酶,对糖代谢的调节和血糖稳态的维持具有重要作用。
测定原理:
GCS催化UDPG和葡萄糖残基生成糖原和UDP,丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶进一步依次催化NADH氧化生成NAD+,在340nm下测定NADH下降速率,即可反映GCS活性。
需自备的仪器和用品:
分光光度计/酶标仪、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研钵、冰和蒸馏水。
试剂的组成和配制:
提取液:100mL×1 瓶,4℃保存;
试剂一:液体 18 mL×1 瓶, 4℃保存;
试剂二:液体 2.5mL×1 瓶,4℃保存;
试剂三:液体×1 支,4℃保存;
试剂四:粉剂×1 支, -20℃保存;
试剂五:粉剂×1 支, -20℃保存;
样本的前处理:
按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL提取液),进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。
测定步骤:
1、 分光光度计或酶标仪预热30min以上,调节波长至340nm,蒸馏水调零。
2、 工作液的配制:临用前将试剂三和试剂四转移到试剂一中混合溶解待用;现配现用;
3、 试剂五的配制:临用前在试剂五中加入1mL试剂二充分溶解待用;现配现用;
4、 将工作液和试剂五置于37℃预热5分钟。
5、 在1mL微量石英比色皿或96孔板中加入10μL样本、10μL试剂五和180μL工作液,立即混匀,记录340nm处初始吸光值A1和1min后的吸光值A2,计算ΔA=A1-A2。
注意:在该试剂盒中,若ΔA 大于0.1,需将样本用提取液稀释适当倍数后测定,使ΔA小于0.1 可提高检测灵敏度。计算公式中乘以相应稀释倍数。