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(UDP-glucose pyrophosphosphprylase ,UGP)试剂盒说明书
紫外分光光度法
注意:正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
测定意义
UDPG焦磷酸化酶是生物体糖原合成过程中的关键酶。在葡萄糖合成糖原前催化葡萄糖活化,将1-磷酸葡萄糖与UTP分子合成为UDP-葡萄糖(UDPG)。
测定原理
UGP可逆催化反应生成1磷酸葡萄糖,在磷酸葡萄糖变位酶和6-磷酸葡萄糖脱氢酶作用下将 NADP转化为NADPH,340nm的吸光值增加速率反映了UGP活性。
自备实验用品及仪器
天平、低温离心机、研钵、紫外分光光度计、1mL石英比色皿。
试剂组成和配制
提取液:液体 50mL×1 瓶,4℃保存。
试剂一:液体 25mL×1 瓶,4℃避光保存。
试剂二:粉剂×1 瓶,-20℃避光保存。临用前加 5mL 蒸馏水充分溶解。
试剂三:粉剂×1 瓶,-20℃避光保存。临用前加 5 mL 蒸馏水充分溶解。
试剂四:粉剂×1 瓶,-20℃避光保存。临用前加 5 mL 蒸馏水充分溶解。
试剂五:液体 5mL×1 瓶,4℃保存。
酶液提取
1. 组织:按照质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g,加入1mL提取液)加入提取液,冰浴匀浆后于4℃,10000g 离心10min,取上清置冰上待测。
2. 细胞:按照细胞数量(104个):提取液体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500万细胞加入1mL提取液),冰浴超声波破碎细胞(功率300w,超声3秒,间隔7秒,总时间3min);然后4℃,10000g 离心10min,取上清置冰上待测。
3. 液体:直接检测。
测定操作
1. 分光光度计预热30min,调节波长至340nm,蒸馏水调零。
2. 取1mL石英比色皿,依次加入500μL试剂一,100μL试剂二,100μL试剂三,100μL试剂四,100μL试剂五,100μL粗酶液,充分混匀,记录340nm处30s的吸光值A1和330s的吸光值A2,△A=A2-A1