酵母(saccharomyce) 是基因克隆实验中常用的真核生物受体细胞，培养酵母菌和培养大肠杆菌一样方便。酵母克隆载体的种类也很多。酵母菌也有质粒存在，这种2pm 长的质粒称为2um 质粒，约6 300bp。这种质粒至少有一段时间存在于细胞核内染色体以外，利用2pm 质粒和大肠杆菌中的质粒可以构建成能穿梭于细菌与酵母菌细胞之间的穿梭质粒。酵母克隆载体都是在这个基础上构建的。

酵母是一些单细胞真菌，并非系统演化分类的单元。一种肉眼看不见的微小单细胞微生物，能将糖发酵成酒精和二氧化碳，分布于整个自然界，是一种典型的兼性厌氧微生物，在有氧和无氧条件下都能够存活，是一种天然发酵剂。一般泛指能发酵糖类的各种单细胞真菌，可用于酿造生产，也可为致病菌——遗传工程和细胞周期研究的模式生物。酵母菌是人类文明史中被应用得*早的微生物。目前已知有1000多种酵母，根据酵母菌产生孢子（子囊孢子和担孢子）的能力，可将酵母分成三类：形成孢子的株系属于子囊菌和担子菌。不形成孢子但主要通过出芽生殖来繁殖的称为不完全真菌，或者叫“假酵母”（类酵母）。

一、材料、仪器与试剂

材料：酵母菌、酵母固态发酵酒醅、黄水等；

仪器：气质联用仪、灭菌锅、窖粮糟、锥形瓶、烧杯、接种针、接种环、移液枪等；

试剂：YPD培养基、糟醅浸汁液体培养基、蒸馏水等。

二、固态发酵步骤

（一）、酵母活化

1、将保存菌种的EP管取出，4℃冰箱中解冻2-3h。

2、用牛皮纸包好130个平板（每个包12个）、4支接种针、130支10mL试管，并将1000mL蒸馏水（洗脱酵母用，130*5=650mL，实验时制备1000mL）分装至4个500mL锥形瓶中，塞好棉花塞后，用牛皮纸包好，121℃灭菌20min，灭菌完成后移至超净工作台冷却，备用。

3、配制YPD培养基（130株菌，共计130*30mL=3900mL，实验时制备4000mL备用）

（1）称取40g酵母膏, 80g蛋白胨于4000ml水中，加入80g琼脂粉于电磁炉专用锅（2个）中，加热搅拌溶解，用盐酸与氢氧化钠溶液调pH为4.5，分装至16个500mL锥形瓶中；

（2）塞好棉花塞后，用牛皮纸包好，121℃灭菌20min；

（3）灭菌完成后移至超净工作台冷却至50℃-60℃，制备平板共计130个。

4、接种酵母，培养

（1）在超净工作台上，用接种针将EP管中的酵母挑取到制备好的平板上划线（每株菌一个平板）；

（2）贴好标签后，移至恒温培养箱中28℃培养至形成肉眼可见的单菌落。

5、制备酵母菌悬液

（1）在超净工作台上，向平板中加入5mL先前制备好的无菌蒸馏水（条件允许时用酵母生理盐水），用接种针挑动，洗脱菌落，得酵母菌悬液；

（2）移至10mL试管中，塞好棉花塞后，贴好标签，备用。

（二）、实验设备转移（实验室至生产现场）

1.准备约140个玻璃发酵坛（每株菌一个共130个，空白糟醅（未拌酒曲）一个、生产厂方发酵生产糟醅（加无菌水5%）一个、发酵完成但未蒸馏的糟醅一个、老师实验用2个、其它5个），装箱；

2.准备150双塑料手套、一张约10平方米塑料纸、150张保鲜膜、10个50mL烧杯（拌黄水与菌种用）、4支玻璃棒，2-4壶开水（在厂方接取）等；

3.将上述物品与制备好的酵母菌悬液（试管）一并用车带至生产厂方，备用。

（三）、接种、拌和、封坛

1.将10平方米的塑料纸铺开，铲取130*700=91000mL约130*500=65000g=65kg（实验时可相应增加使用量）的糟醅（未拌酒曲）于塑料纸上；

2.分2-4组，拌和。每株菌用35mL黄水、700mL(500g)糟醅、5mL酵母菌悬液。

（1）用开水将烧杯与玻璃棒灭菌，冷却；

（2）移取700mL(500g)糟醅于一张保鲜膜上，将35mL黄水与5mL酵母菌悬液在烧杯中用玻璃棒拌匀后倒在糟醅上，带上手套拌和均匀（每株菌用一双手套、烧杯与玻璃棒拌菌后用开水灭菌，冷却）；

（3）将拌好菌的糟醅移至发酵坛中，压至理想程度后，盖上坛盖，用细沙封口，贴好标签。

（4）将发酵坛转车运回实验室30℃恒温培养30d（开空调调温），定期观察记录。

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