C-33A(C33A)人宫颈癌细胞

C-33A(C33A)人宫颈癌细胞需要不断供给氧气和排除二氧化碳，植物细胞与此相反。二氧化碳的作用：调节pH，有缓冲作用，没有刺激动物细胞呼吸的功能。

简言之，即细胞需要什么就提供什么，道理是如此，真正能做到这点尚需时日，人们至今对细胞的生命周期控制机理认识不足，癌细胞虽然也来自正常细胞，但至今不知道究竟为什么癌细胞很难停止已经启动的有害分裂，尽管如此，人们的研究结果表明，离体细胞培养需要的基本条件就是下列细胞生理条件。

1. 温度：温度过低时细胞生长缓慢甚至不生长。利用冷冻保藏细胞可保持细胞的原有分裂分化能力。温度过高导致细胞死亡。这主要是由酶和蛋白质所需要的适温度决定的。多数生物大分子遇到高温后容易导致空间结构改变或者丧失（变性）。细胞膜遇到高温后容易变化。在自然界，既有耐高温的恒温培养箱恒温培养箱细胞，也有耐低温的细胞。在情况下生长的生物对付环境的机制研究在生物进化和农业、环保、发酵工业中意义重大。

2. pH：过酸或过碱可导致细胞死亡。这主要与蛋白质的变性和细胞膜的结构受损有关。

3. 透压：细胞内外可溶于水的物质比例和种类决定细胞的膨胀与收缩程度，因为细胞膜是半透膜，只允许对自己有利的物质通过。

同一物质在细胞内外的分布的数量不同，当某一种极溶于水的物质在细胞外浓度过大时，有可能导致细胞干瘪死亡，这些物质在细胞内过多时导致细胞过量吸水膨胀。细胞膜调节渗透压的能力是有限的。

4. 养物：营养物和水一起，又叫细胞培养液，培养液中含有细胞增殖和生长所需要的各种物质。营养物包括：N 源、C源，这些物质与提供能量有关；无机盐、维生素、激素，这些物质与代谢调节控制有关。细胞培养液的设计一直是细胞离体培养技术的关键。

理想的细胞培养液可以同时解决细胞离体培养所需要的pH、渗透压、营养物、调节物质的全部需要。在干细胞分化研究与应用中，关键是找到一种使干细胞分化成为所需细胞和组织的营养液。相同的人干细胞，放在不同的营养液中分化培养出人的各种脏器，这个昔日的梦想已经开始成为现实。

植物细胞的组织培养技术已经基本完善配套。名贵花卉、中草药、脱毒马铃薯、组织培养莲菜苗等植物细胞与组织培养技术的不断完善，特别是由于组织培养液的商品化已经被广大农民普遍接受。

5. 水：水是细胞需要数量大的物质，不同的物种、不同部位、不同生的细胞含水量差别相当大。干旱植物细胞的含水量高达90%。水的需求量一般随同细胞培养液一起考虑。

6. 无菌条件：体外细胞培养仅仅是对所需的细胞进行培养，但环境中（如空气）有各种其他微生物，必须对所需细胞进行无杂菌的隔离培养。无菌条件是细胞离体培养基本的条件。

7. 光：植物细胞和少数细菌需要利用光进行光合作用。

8. 气体:动物细胞需要不断供给氧气和排除二氧化碳，植物细胞与此相反。

二氧化碳的作用：调节pH，有缓冲作用，没有刺激动物细胞呼吸的功能。

细胞复苏与传代方法：

一、实验前准备工作：

1、培养瓶的包被：包被液如多聚赖氨酸（PLL，ScienCell品牌，货号0403或0413）或纤维粘连蛋白（BPF，ScienCell品牌，货号8248），以无菌水稀释至2 ug/cm2的浓度包被培养瓶。37度孵箱1小时或4度过夜，从包被好的培养瓶中回收多聚赖氨酸，并用无菌水洗涤培养瓶2遍。包被好的培养瓶不要放置超过24小时，其中的包被液可吸出重复使用2-3次，注意不要污染。

2、培养基的配置：以内皮细胞培养基（ECM，ScienCell品牌，货号1001）为例，把配套的胎牛血清（FBS，ScienCell品牌，货号0025）、生长因子（ECGS，ScienCell品牌，货号1052）和双抗（P/S，ScienCell品牌，货号0503）加入基础培养液（ECM，ScienCell品牌，货号1001）中。重新贴好标签，并混匀培养基。

二、原代细胞复苏方法：
1、从液氮中取出原代细胞冷冻管，迅速投入37～38 ℃水浴中，其间可以轻轻转动细胞，加快融化速度，大约需要1分钟时间。
2、5分钟内用培养基稀释至原体积的10倍以上，加入培养瓶中，再用1ml培养基洗涤细胞冻存管，细胞都被加入培养瓶中，静置于孵箱，12-16小时后更换培养基（除去DMSO）。以后每2天换一次液，细胞状态良好。

三、原代细胞传代方法：酶消化法
当细胞生长至70-80%左右可以传代，传代比例以1:2或1:3为佳。具体方法如下：
1、弃去培养瓶中培养基，用PBS洗涤培养瓶2遍，加入0.25%的胰酶消化液（Trypsin-EDTA，ScienCell品牌，货号0103），以消化液能覆盖整个瓶底为准。37度孵育4分钟左右，轻拍培养瓶侧面，显微镜下观察细胞消化情况，直到80%细胞呈现圆形。
2、细胞消化好后，加入胰酶中和液（TNS，ScienCell品牌，货号0113），并轻轻摇动培养瓶，形成细胞悬液，然后将细胞和培养基转移至离心管中，1000rpm离心5分钟。

3、弃去上清液，以1-2ml新鲜培养基重新悬浮细胞并吹打均匀，接种于包被好的新培养瓶中，瓶中已有10ml左右的培养基，放入培养箱中培养，每2天更换培养基。

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