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人钙调磷酸酶试剂盒加样
加样应用微量移液器（加样枪）按规定的量加入微孔板的1/3处避免加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡。
每次加样应更换吸嘴，做到人吸头，以免发生交叉污染;干吸头预先在血清中抽吸三次。
样本稀释，目的是为了减少非特异性反应，所以定要先加稀释液后加样本，特别注意加样后要在微量振荡器上振荡30钟，同时注 意防止液体溢出。如后面操作步骤中加二种以上试剂时均需振荡混匀。
如用滴瓶滴加试剂应先将滴瓶摇匀并挤去*滴有气泡的试剂后加样。
温育
抗原抗体反应需要在定温度下（37°C），经过定的时间才能达到反应的平衡点
ELISA边缘效应是由温育形成的。所以温育般采用能 使反应液温度迅速达到平衡的水浴法。种放在水浴箱的隔板上，另种是放在温箱的湿盒里。水要浸至板条的1/3处，不可将板条叠 加放置。
边缘效应（2ng/mlHBsAg步法三种不同温育法的结果）
洗涤
ELISA是靠洗涤来达到分离结合与未结合抗原抗体复合物及酶标记物的目的，同时洗涤也可将非特异吸附的蛋白质的干扰以及血球 、细菌中的酶干扰清除掉。
手工洗涤般采用浸泡方法：
1）甩去孔内反应液；
2）用洗涤液过洗遍（即注满孔后即甩去）；
3）微孔重新注满洗液后浸泡2-3分钟，间歇摇动；
4）甩去孔内液体，拍板，用纸吸干。
重复以上操作至少5次。注意各种试剂盒的洗涤液尽量不要混用。
洗板机洗板定要预先把板架放平，使洗板机上的每个放液和吸液纤孔都能*地插入孔底，将孔内液体全部吸干，同时要设置定的 浸泡时间。如出现机洗后拍板有较多残留液时应再用手工洗2次以上。关机要用蒸溜水冲洗管道，避免堵孔。
显色
HRP催化底物的步呈色反应，同样需要定的时间和温度，
定要按照说明书规定的时间温度（般为37°C，10-15分钟）恒定反应后终止
或根据临界值质控血清吸光度值达0.2左右使的时间而恒定反应时间。
