1.什么是单克隆源性鉴定

单克隆源性即对生产的抗体进行溯源，确定是由单一细胞克隆产生的高度均一的抗体。

2.单克隆源性鉴定目的

近年来重组蛋白药物在治疗疾病，尤其是肿瘤方面有重大应用，而重组蛋白药物大多数由哺乳动物的CHO细胞表达产生。药物评审单位要求研发企业出具该药物所使用细胞的单克隆源性，因此验证工程细胞的单克隆源性是维持蛋白药物一致性的重要手段。

3.单克隆获取方法

克隆性被认为可以减少细胞库的异质性，常用的单克隆获取方法，如：有限稀释法、ClonePix、流式细胞荧光分选技术、单克隆挑选新技术等。

3.1有限稀释法（limiting dilution cloning, LDC）

有限稀释法是一种常用的克隆方法，要求铺板密度小于0.5cell/well，该方法的优点是操作简单，对设备的需求比较低，缺点是耗时较长，效率低，并且对人工依赖性比较高，受实验操作人员，实验环境、条件等因素的影响易产生不同结果。

3.2 ClonePix法

ClonePix是一种高通量的单克隆筛选设备，该方法人工干预少，通量大、效率高，筛选的准确性高。但相比于有限稀释法，ClonePix法筛选的单克隆培养基和后期的生产工艺培养基差距更大，有限稀释法的克隆在孔板的表现更接近于生产时的状态。

3.3流式细胞荧光分选技术（FACS）

流式细胞荧光分选技术（FACS）是根据细胞大小、荧光染料和细胞表面marker等因素挑选出所需要的单细胞。该方法的优点是单克隆形成率很高，缺点是需要通过条件优化，使挑选的细胞与孔板的孔一一对应，流式细胞仪、细胞的形态及状态对分离效果有影响。

3.4单克隆挑选新技术

目市场上有多种单克隆筛选设备可选择，如单细胞打印、Solentim VIPS等，可以减少对人工的依赖。目获得单克隆基本上是以上方法的反复联用和使用。

4.荧光原位杂交技术鉴定单克隆源性

利用荧光原位杂交技术来检测细胞是否来源单一，其结果可视化，具有说服力。

荧光原位杂交技术是利用荧光检测系统对DNA进行定性、定量或相对定位分析的技术，其基本原理是根据DNA序列的互补性，用已知的荧光素、生物素标记的核酸探针与待检测样本的DNA进行杂交，形成可检测的双链核酸杂交。

5.荧光原位杂交技术优势

荧光原位杂交法具有其他杂交方法没有的优势：

（1）FISH是非放射性元素标记，更加安全；

（2）FISH的实验周期短，可同时检测多种序列；

（3）FISH技术因其多次免疫化学反应增强了杂交信号，灵敏度与放射性探针相当。

6.卡梅德生物能够为客户提供高质量的单克隆源性鉴定服务

卡梅德生物（KMD Bioscience）多年来深入细胞生物学技术研究，我们拥有经验丰富的科研家团队、实验技能精湛的实验团队、完善的细胞培养平台以及完备的实验仪器和实验条件，搭建了完备的荧光原位杂交技术服务平台，积累了大量的成功经验。凭借扎实的业技术，我们可以定制化提供从探针设计到细胞单克隆源性鉴定全套服务，力求以低成本效益的方式为客户解决问题。

7.荧光原位杂服务交流程介绍

卡梅德生物可以提供荧光原位杂交服务，主要技术流程如下：探针设计与合成，样本处理，原位杂交实验，成像拍照，结果分析与项目报告。

7.1探针设计和合成

7.1.1即用型探针可以直接杂交，非即用型探针需要与与杂交液按 1：1：1：50 比例稀释，85℃变性 3 分钟，37℃平衡 5 分钟。

7.2样本处理

7.2.1脱蜡复水，将石蜡切片浸入二甲苯中脱蜡，2 次，每次 10 分钟；

7.2.2片子依次过 100%、85%、75%乙醇，各 3 分钟，PBS 3 分钟；

7.2.3 片子加胃蛋白酶消化液，37℃消化 15-30 分钟，PBS 洗涤 2 次，每次 3 分钟；

7.2.4预杂交：提 30 分钟从冰箱中取出杂交液恢复至室温，滴加杂交液，杂交仪中55℃孵育 1 小时。

7.3原位杂交实验

7.3.1取出预杂交好的片子，去除多余液体，将探针滴加于片子上，覆盖组织， 放于杂交仪中 37℃杂交过夜；  

7.3.2片子入 2×SSC（0.1％NP-40）中洗涤 3 次，每次 5 min；

7.3.3 滴加 20ul DAPI-Antifade Solution 盖玻片封片，避光孵育 20min。

7.4成像拍照

利用本荧光原位杂交技术CHO细胞实验结果拍照：

单克隆源性验证实验

7.5结果分析与项目报告

卡梅德生物交付：剩余的探针、切片以及样品，原始杂交显色成像照片，详细的实验报告（包含完整的实验流程及结果分析）。

总之，鉴定单克隆源性是重组蛋白药物质量一致性的提，在药物申报时缺乏单克隆源性鉴定的证据会导致无法通过。卡梅德生物研究单克隆源性鉴定多年，利用荧光原位杂交技术，可为广大药企药物申报环节提供关键的数据结果。卡梅德生物可以检测100-200个细胞，服务周期短，助力于企业药物申报之路。

原创作者：卡梅德生物科技（天津）有限公司