一．哺乳动物表达系统简介

哺乳动物细胞表达系统的独特优势还在于它们能够快速进行翻译或后位修饰，形成正确折叠，可以被人工改造成类人体源性，免疫原性较好，在分子结构、理化组织性质特征以及其生物学功能方面也基本接近人类天然高等生物蛋白质分子。

二．哺乳动物细胞表达载体类型

根据进入宿主细胞的方式，可将表达载体分为病毒载体与质粒载体。

1.质粒载体：由真核复制信号、启动子、转录单位以及质粒片段构成。常用的pcDNA3.1载体具有以下特点：具有正向（+）或反向（-）的大分子多克隆位点；具备高水平表达蛋白的巨细胞病毒（CMV）增强子启动子；牛生长激素（BGH）多聚腺苷酸化信号和转录终止序列用于增强mRNA稳定性；氨苄青霉素耐药基因和pUC复制区序列用于大肠杆菌中的选择和维持。

2.病毒载体：以病毒颗粒的形式，通过与病毒包膜蛋白复合物及其受体与原载宿主细胞膜表面产生的蛋白质进行相互交联等作用机制来诱使原宿主外源基因载体直接地进入新宿主细胞内。几种广泛用到的整合型病毒载体如下：

三．哺乳动物表达系统常用受体细胞

1. CHO细胞系：CHO细胞系是哺乳动物蛋白质生产的主要细胞，适应性强，可在悬浮培养基中高密度生长，并易于适应无血清条件，但其克隆稳定性差。CHO细胞具有不同的谱系：CHO-K1，CHO-S，CHO-DG44和CHO-DXB11。

2.HEK293细胞系：是另一个衍生出自人的胚胎肾细胞中的细胞系，具有基因转染繁殖效率比较高，易于重复培养繁殖等的特点；293细胞中的其中一个衍生株：293T/17的转染效率则更高。293细胞的缺陷可能是由于生长繁殖过程中的贴附壁强度一般比较小，所以营养物质在整个实验繁殖过程中较容易大量流失，从而会影响整个实验繁殖结果。

四．外源基因导入受体细胞的方法

1. 感染性病毒颗粒感染宿主细胞。

2. 通过脂质体法、显微注射法、磷酸钙共沉淀法导入及DEAE-葡聚糖法等将非病毒载体导入融合载体的几种特殊技术方式来快速将多种病毒基因的载体快速导入及融合移植到宿主受体细胞中。

五．表达系统常见问题

（一）表达系统的选择：1.蛋白表达产物的需求量多少；2.表达的蛋白的实际用途是什么；3.实验处理所需处理时间多久；4.对宿主细胞具有的毒性。

（二）其它影响细胞蛋白正常表达数量的一些因素：培养的环境空气中含有营养离子和某些生长诱导因子的缺乏、缺氧、病毒感染、毒性代谢物的过量积累、机械的搅动损伤以及培养容器压力负荷的持续增加等很多生因素都有可发生诱导的细胞凋亡，培养细胞的大量死亡也严重的影响了蛋白的正常表达产量。

（三）提高蛋白表达的措施：1.在考虑如何才能提高单位细胞生产率方面，宿主细胞结构的改造等工作时通常也需要同时从重组蛋白的折叠、运输、修饰、分泌等共五个重要方面上综合考虑；2.优化细胞体外培养、蛋白制备纯化工艺，降低宿主细胞在体内培养过程中游脱离脱氨类物质和游离蛋白乳酸盐类蛋白等各种有害物质的堆积，改善宿主细胞体外正常生长或发育繁殖环境，提高宿主细胞有效的生长密度，将增加宿主细胞重组蛋白的总产量；3.工业生产常用的细胞的体外培养技术方法有细胞分批体外培养、流加培养的方法和灌流式细胞培养技术方式等；4.细胞死亡主要有三种：组织细胞坏死凋亡过程和另外两种包括程序性细胞死亡的过程即细胞凋亡反应过程和体外组织的自噬，目在国内外应用主要都是采用有以下这两种技术策略来构建细胞抗诱导的凋亡反应细胞，增加抗凋亡基因表达的和体外的表达和抑制促细胞凋亡反应基因的表达。

六．卡梅德可提供：

1. 密码子优化、载体构建以及目的基因的亚克隆服务。根据对HEK293和CHO密码子的偏好性可以直接对目的序列进行密码子序列的优化，综合考虑了特定功能序列的修饰、GC含量、重复序列、以及对mRNA序列的二结构修饰等多方面进行系统研究与优化。

2. 哺乳动物细胞转染，稳定筛选转染细胞。既能够采取瞬时转染表达方法，短时间内获得少量蛋白，同时还可以构建稳定细胞系平台，长时间稳定生产。

3. 对重组蛋白进行小量表达，对蛋白的表达量及蛋白性质进行评估。

原创作者：卡梅德生物科技（天津）有限公司