载体构建（Vectorcon Struction）是进行分子生物学研究的常用手段，使用该技术将外源DNA片段插入至人工构建的质粒中，目的是把连接好的DNA分子运送到受体细胞当中进行复制扩增用于后续的科研试验。

2. 常用的载体构建方法？

目常用的载体构建技术包括重叠延伸PCR法、传统的酶切连接法以及同源重组法等。传统的酶切连接法是用相同的限制性内切酶对质粒和含有目的片段DNA进行消化，得到具有相同的粘性末端或平末端的线性DNA，纯化酶切产物，再利用DNA连接酶片段与载体相连，得到重组质粒。将重组质粒转入感受态细胞中，进行后续的筛选、扩增。同源重组克隆技术通过同源重组酶将两个具有相同末端序列的线性化载体和插入片段重组成重组质粒，同样转入感受态细胞中进行筛选、扩增。

3.  常用的载体构建表达系统？

原核系统表达载体：大肠杆菌表达系统要求载体包含SD序列、一个强的启动子及其两侧的调控序列、启动子与外源基因之间有正确的阅读框架以及外源基因下游的转录终止区。常用的载体是pET系列和pGEX系列。卡梅德生物通过密码子优化、改造表达载体元件以及融合标签与宿主的多样性选择等实现重组蛋白的显效表达。

哺乳动物细胞表达载体：包含原核序列、启动子、增强子、选择标记基因、终止子和多聚核苷酸信号等控制元件，载体选择主要为pcDNA3.1系列和pcDNA4系列。卡梅德生物设计的高表达载体能为客户提供高表达水平的重组蛋白哺乳动物细胞表达与制备服务。

酵母质粒载体：由选择标记（例如营养缺陷型筛选标记HIS3、抗生素筛选标记氯霉素等）和调控序列（包括启动子、ARS、2μM质粒、酵母着丝粒区段等），载体选择主要为pPIC9系列和pPIC3.5系列。卡梅德生物能够同时为客户提供多种规格的蛋白酵母发酵规格、配合蛋白纯化平台，在短时间内获得高质量的重组蛋白。

昆虫表达载体：杆状病毒表达载体是以Sf9和Sf21细胞系以及家蚕为表达宿主，将外源基因克隆于转移载体上，与病毒DNA共转染细胞后，经同源重组和筛选而得到重组病毒。载体选择主要为pFastBac1系列和pFastBacHT系列。卡梅德生物根据Sf9，Sf21，Hi-5及S2昆虫细胞的密码子偏爱性，免费为您进行密码子优化，从而有效提高重组蛋白表达量。

4. 载体构建的基本流程？

4.1酶切连接法

（1）载体选择：

根据构建重组质粒的目的不同选择合适的载体，并对目的片段与载体含有的酶切位点进行分析。

（2）引物设计：

能与目的片段特异性结合并进行扩增，引物长度约18-25bp，GC含量在40%-60%之间，需要加入两个合适的酶切位点。

（3）PCR扩增：

以研究对象的DNA/cDNA为模版，经PCR扩增目的片段后，使用1%琼脂糖凝胶电泳检测和回收目的基因条带。

（4）载体和目标片段的限制性酶切：

使用相应的限制性内切酶，对目的片段和质粒载体进行双酶切实验。加样全程于冰上操作，用移液枪吹匀样品，轻弹管底去除气泡后再用掌心离心机将样品甩至管底，终于37℃水浴锅内酶切1.5 h。反应结束后对产物进行1%琼脂糖电泳，若条带位置正确则对其进行产物回收。

（5）连接转化：

使用T4 DNA Ligase对酶切后的回收产物进行酶连。该酶在16℃条件下对粘性末端连接效率很高，酶连过夜即可充分连接。

（6）挑取单克隆提取质粒验证：

菌液PCR：将单克隆菌落挑至含有相应抗性的1.5 mL EP管中培养4~5 h，按照扩增目的片段所用的PCR体系加入各组分，其中将模板DNA为菌液（体积1 µL），同时设置水为模板的阴性对照组以及扩增的目的片段作为阳性对照组。反应完毕后将所有样品进行1%琼脂糖凝胶电泳，根据条带亮度以及位置初步判断是否酶连成功。

酶切验证：以目的片段的双酶切组作为阳性对照，以空载的双酶切组作为阴性对照，将反应后样品进行1%琼脂糖凝胶电泳。若样品组有与阳性对照组和阴性对照组位置一致的两条带，则进一步证明该重组质粒连接成功。

测序验证：送至测序公司，比对结果进行验证。

4.2同源重组法

（1）载体线性化：使用限制性内切酶消化法或反向PCR扩增法，选择合适的克隆位点对载体进行线性化。

（2）插入片段的获得：在插入片段正反向扩增引物的5’端引入线性化载体两末端同源序列，使扩增后的插入片段5＇和3＇末端分别带有和线性化克隆载体两末端对应一致的同源序列（15-20 bp，不包括酶切位点）。

（3）重组反应：回收琼脂糖凝胶电泳产物，根据测得的浓度计算重组反应所需的线性化载体和插入片段所需DNA量。

（4）转化感受态

（5）重组反应产物鉴定：菌液PCR、测序。