一．哺乳动物细胞表达系统

哺乳动物蛋白质表达系统明显的优势，是可以促进蛋白质的正常折叠和对糖基化等翻译后修饰，进而提高了蛋白质的天然活力，目已作为表达和制备部分蛋白质药物、基因工程抗体等目的蛋白的宿主。

卡梅德生物建立了完善的哺乳表达体系，包括但不限于FreeStyle 293-F cell line和Expi CHO-S等细胞系，配合卡梅德设计的高表达载体（含有全长的CMV启动子以及优化后的分泌信号肽序列），能够为客户提供更高表达水平的重组蛋白哺乳动物细胞表达与制备。

二．哺乳动物细胞表达系统的构建

（一）重组蛋白瞬转、稳转表达载体的构建

从NCBI获取目的蛋白的cDNA序列，设计特异性上下游引物，将酶切位点引入到目的基因的两端，再将扩增片段克隆至pCDNA3.1表达载体中构建重组质粒。

（二）重组蛋白在Expi293细胞中的瞬时表达、纯化及鉴定

1. Expi 293细胞的复苏：将培养基加热至37℃，然后将从液氮瓶中提取的Expi 293细胞于37℃的水浴锅中水解，然后转至细胞摇瓶内，再放入CO₂细胞培养摇床内，在37℃，120 rpm，8%的二氧化碳环境下进行培养。

2. Expi 293细胞的传代：细胞复苏78h后，从CO₂细胞培养摇床中取出，放入生物安全柜中，用台盼蓝染色法对细胞进行计数。代细胞密度增长至5×10⁶个/mL，取3 mL细胞培养液加入装有27 mL新鲜的培养基的摇瓶中，37℃，120 rpm，8%CO₂条件下继续培养。

3. 重组质粒瞬时转染Exipi 293细胞：

（1）Expi293 细胞传代两次后，从CO₂细胞培养摇床中取出，在生物安全柜中，使用血细胞计数板对细胞进行计数。

（2）当细胞密度达到5x10⁶个/mL，收集培养液，3000 rpm， 5 min，弃去上清液，新鲜的OPM-CD05培养基重悬并转移至新的细胞摇瓶中。

（3）取1支灭过菌的离心管，将制备好的重组质粒用0.22 μm滤膜过滤除菌。取1支灭过菌的15 mL的离心管，加入12 mL Opti-MEM孵育液，120 μg质粒，终浓度为2 μg/mL,再加入360 ug PEI,终浓度为6 ug/mL，混匀之后， 室温静置15 min。

（4）将上述溶液缓慢加入待转染的细胞中，将细胞摇瓶密封后，做好标记， 37°C，120 rpm，8%CO₂的条件下继续培养。

（5）转染后第1、3、5天，吸取200 μL细胞培养液，在倒置荧光显微镜下，分别通过绿色荧光和白光观察重组质粒转染状况。

（6）表达产物的纯化：根据蛋白携带的标签或蛋白相关性质选择合适的纯化方式。

（7）SDS-PAGE、Western Blot鉴定纯化产物。

（三）CHO-S稳定表达细胞系的构建、筛选及鉴定

1. 贴壁CHO-S细胞的复苏：37°C预热贴壁CHO-S细胞培养基，将CHO-S细胞溶解后，转移至培养瓶中， 37°C，120 rpm，8%CO₂的条件下培养。

2. 贴壁CHO-S细胞的传代：同上述Expi 293细胞。

3. 贴壁CHO-S细胞转染细胞密度的优化；PEI投入量的优化；重组质粒投入量的优化。

4. 稳定表达目的蛋白的贴壁CHO-S细胞的筛选

5. 稳定表达目的蛋白的CHO-S细胞悬浮驯化

三．瞬时质粒转染和稳定转染的实验原理异同

同：通过把目的基因转染至某些哺乳动物细胞中，从而表达并得到了目的蛋白。

异：它并不是通过质粒转染在细胞的染色体上而是存在于细胞游离的载体中，这样就能够在短时间内得到目标基因的表达产物，不过由于细胞的持续分化与增殖外源基因终也会丢失，因此不能持续完成重组蛋白的制备工作；而通过细胞稳定性质粒转染，则可以使外源基因转染在细胞染色体组中，目的基因并不由于细胞传代而消失，因此稳定质粒转染的细胞株就可以长时间而持续的制备重组蛋白。

四．哺乳动物细胞表达系统的优势

1. 表达的重组蛋白，在生物学特性和分子结构上与天然蛋白分子很相似。

2. 哺乳动物细胞产生的内源性杂蛋白少，在信号肽的作用下，表达产物可胞外分泌，方便目的蛋白的分离纯化。

五．哺乳动物细胞表达系统的应用

1.纯化蛋白的生产（结构、酶、药物发现）；

2.药物蛋白生产；

3.基于细胞的研究。

卡梅德生物建立了完善的哺乳表达体系，包括但不限于FreeStyle 293-F cell line和Expi CHO-S等细胞系，配合卡梅德设计的高表达载体（含有全长的CMV启动子以及优化后的分泌信号肽序列），能够为客户提供更高表达水平的重组蛋白哺乳动物细胞表达与制备。

原创作者：惠州市宏升教育投资管理有限责任公司